А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 125
Текст из файла (страница 125)
Для получения оптимального количества колоний (около 100 на 1 чашку) необходимо сделать 5 десятикратных разведений исходной суспензии. Наносят на поверх- 425 ность чашки Петри с 1,5 ее питательным агаром в двух повторностях 0,1 мл последнего (пятого) разведения каждой пробы и растирают шпателем. После инкубации чашек в течение ночи при 37 'С подсчитывают количество образовавшихся колоний, определяют концентрацию бактерий в 1 мл в каждой пробе и строят кривую зависимости мутности суспензии от концентрации бактериальных клеток в данных условиях. ЗАДАЧА 2. ВЫРАЩИВАНИЕ Т-ЧЕТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ Получение фаговой суспензии с высоким титром требует определенного опыта работы с системой «фаг — клетка».
При внесении небольшого количества фага в культуру чувствительных бактерий, активно размножающихся в жидкой питательной среде, частицы бактериофага адсорбирукпся на бактериальных клетках и после латентного периода лизируют их. Освободившееся в среду потомство частиц бактериофага заражает клетки, не вовлеченные в процесс инфекции, вызывая второй инфекционный цикл.
Таким образом, последовательно заражаются все клетки суспензии, и процесс продолжается асинхронно до тех пор, пока не произойдет лизис всех чувствительных бактерий. Теоретически выход фага равен численности популяций бактерий, умноженной на величину среднего выхода фага при лизисе клетки.
Действительный выход часто меньше, так как некоторые из освободившихся вирусных частиц утрачиваются в результате повторной адсорбции на инфицированных, но не лизировавшихся бактериях или на обломках бактерий. Период времени, необходимый для ливиса всех клеток, зависит главным образом от продолжительности латентного периода и числа введенных фаговых частиц. На процесс фаголизиса влияют также температура, степень аэрации, состав питательной среды, реакция среды и физиологическое состояние бактерий.
Так, например, заражение бактериальной культуры в стационарной фазе не приводит к появлению фагового потомства. В конце логарифмической фазы роста концентрация клеток в питательном бульоне составляет около 1 10з в 1 мл. Если такую культуру заразить достаточным количеством фага (1-1Оз фиговых частиц в ! мл), то все бактерии инфицируются почти одновременно и лизис культуры наступит через 1 — 2 ч. При этом можно ожидать, что 1О~ инфицированных бактерий в 1 мл могут дать ! Он фаговых частиц в ! мл, поскольку средний выход (для Т-четных фатов) составляет 1ОΠ— 200 фаговых частиц.
Для получения высокоочищенных фаговых суспензий применяют синтетические среды. С этой целью обычно используют аэрируемые колбы или бугыли, а также всевозможные ферментеры. ~йжраЖ~ р у ~ Гф т~а»п ' ~«р Г Е. соб в качестве хозяина. Ход выполнения задачи В стерильный флакон на 250 мл вносят 30 мл питательного бульона и 3 мл ночной бульонной культуры Е. со(Е Инкубациоьшую смесь ставят на качалку при 37 "С и аэрируют в течение 1,5 ч. После этого берут пробуя количестве 3 мл для определения мутности культуры и установления точной концентрации бактерий по кривой, полученной в задаче 1. Бактериальную суспензию заражают внесением суспензии фага с известным титром при множественности заражения 0,1 (отношение числа фаговых 426 частиц к числу бактериальных клеток).
Азрацию инфицированных фатом клеток продолжают в течение 2 ч, затем добавляют несколько капель хлороформа для разрушения нелизированных бактериальных клеток и продолжают встряхивание в течение 15 мин. Полученный лизат центрифугируют при 3 — 4 тыс. я в течение 20 мин для удаления обломков клеток и фагоустойчивых бактерий и хранят в холодильнике для дальнейшей работы. ЗАДАЧА 3. ТИТРОВАНИЕ ФАГА МЕТОДОМ АГАРОВЫХ СЛОЕВ Активность бактериофага определяют по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или твердых средах и численно выражакл степенью максимального разведения, в котором испытуемый фаг проявил свое литическое действие.
Весьма точно активность бактериофага оценивается количеством инфекционных активных единиц в единице обьема, т.е. определением титра бактериофага. Для этой цели обычно пользуются методом агаровых слоев. Сущность метода состоит в том, что культуру индикаторных бактерий в «мягком«(0,8%-м) агаре при 48'С заражают фагом в соответствующем разведении. Эту смесь выливают на поверхность застывшего 1,5%-го питательного агара, дают застыть верхнему слота агара и ставят на инкубацию в термостат.
В течение б — 12 ч бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара в виде множества мелких колоний, получая питание из нижнего слоя 1„5%-го агара, который применяют как основу. Низкая концентрация верхнего слоя агара создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц. В результате фаговые частицы заражают бактериальные клетки, находящиеся в непосредственном соседстве с ними, размножаются и лизируют их. Фаговое потомство инфицирует затем соседние бактерии, которые в свою очередь подвергаются лизису в результате появления второго поколения фащ, и т.д. В конечном итоге на растущем бактериальном газоне образуются прозрачные зоны отсутствия роста бактерий — негативные колонии, стерильные пятна, нли «бляшки». Образование каждого стерильного пятна может быть вызвано единственной частицей бактериофага. Следовательно, число негативных колоний может служить количественным показателем содержания инфекционных фаговых частиц в исследуемом растворе.
ь««й: ЫЫ . БР « тиц в 1 мл лизатов, полученных ранее при выполнении предыдущей задачи (см. задачу в гл. 36). Ход выполнения задачи В случае, если титр фага предположительно составляет 10'а фаговых частиц в 1 мл, необходимо провести восемь десятикратных разведений исходной суспензии в стерильном физрастворе. Агар для верхнего слоя (0,8 %), предварительно разлитый по 5 мл в пробирки, расплавляют и остужают в водяной бане до 48 С. В таком состоянии агар может храниться в водяной бане -20 мин, так как при более продолжительном хранении он приобретает гелеобразную консистенцию.
Готовят 2 пробирки (й(«1 и )чз 2). В каждую пробирку вносят 0,1 мл ночной бульонной культуры Е. сод. В обе пробирки с мягким агаром и индикаторной культурой добавляют соответственно по 0,1 мл седьмого и восьмого разведений фаговой суспензии, 427 тщательно перемешивают и выливают содержимое на чашку Петри с 1,5 %-м питательным агаром, равномерно распределяя по поверхности агара. После застывания верхнего слоя агара (10 — 15 мин) чашки переворачивают вверх дном и оставляют в термостате при 37 С на ночь.
На следующий день считают количество негативных колоний на каждой чашке и определяют титр фага в исходном препарате с учетом фактора разведения и объема вносимого материала. Например, если при нанесении на чашку 0,1 мл фаговой суспензии при разведении 1 1От на этой чашке образовалось !50 стерильных пятен, то титр фаголизата будет равен (150. 10) . 10" = 1,5 1Ою частиц в 1 мл. ЗАДАЧА 4.
НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ БАКТЕРИОФАГА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИСЫВОРОТКОЙ При внугривенном введении кроликам фаголизатов в сыворотке этих животных образуются специфические антитела, способные нейтрализовать инфекционность гомологичных фаговых частиц. Скорость реакции зависит от концентрации фага, активности сыворотки, температуры и свойств среды и подчиняется кинетическому уравнению первого порядка. При постоянной температуре и постоянстве свойств среды уравнение имеет следующий вид: К= 2,3(В701а(Р,775, где Р« — количество фага при времени О мин; Р— количество фага при времени ~ мин„.
Р— конечное разведение сыворотки в смеси «сыворотка-~бактериофагь Величина К, называемая константой скорости нейтрализации, — показатель активности данной конкретной антифаговой сыворотки. Совпадение или близость значений К в опытах по перекрестной нейтрализации дает возможность установить степень серолоп1ческого родства бактериофагов. Предварительно найденная величина Кданной антисыворотки позволяет оценить оптимальную степень разведения сыворотки, применяемой для инактивации данного препарата фага. Различные фаги существенно отличаются скоростью реакций с гомологичными антисыворотками.
Значения К скорости нейтрализации колеблются от 10 до 10' в зависимости от вида фага. Эта величина зависит также от ряда факторов, не поддающихся контролю (техника иммунизации и индивидуальных особенностей животных). Дель дабогльл определить значения К для антисывороток к фату Т4. Ход выполнения задачи Разведение аитисыворотки. Готовят три разведения антифаговой сыворотки (1: 10, 1: 100, 1: 1000) физиологическим раствором и инкубируют в водяной бане при 37 С в течение 10 мин. Разведение фага. Фаговую суспснзию разводят до титра 1. 1От. Постановка реакции.
В каждое разведение антисыворотки (всего 3 пробирки) объемом 0,9 мл добавляют по О,! мл разведенной суспензии бактериофага и ставят на инкубацию при 37 С на 5 мин. Остановка реакции. Через 5 мин к 0,1 мл каждой смеси «фаг — сывороткаь добавляют 9,9 мл физиологического раствора. На чашки высевают методом 428 атаровых слоев 0,1 мл каждой разведенной смеси, используя в качестве индикаторной культуры е) со!0 Высев проводят для каждого разведения антисыворотки. В качестве контроля берут смесь, состоящую из 0,1 мл суспензии бактериофага и 0,9 мл соответствующего растворителя (вместо разведений антисыворотки).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
