Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 32
Текст из файла (страница 32)
4.54. Относительные значения констант Михаэлиса (КМ) для мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене.За 100% приняты значения КМ фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.196Рис. 4.55. Относительные значения каталитических констант (kcat) для мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене.
За100% приняты значения kcat фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.197Рис. 4.56. Относительные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO с заменами в FAD-связывающемдомене. За 100% принята каталитическая эффективность фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.198Рис. 4.57. Абсолютные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO с заменами вFAD-связывающем домене.199Такимобразом,намибылпроведенподробныйанализструктурыFAD-связывающего домена TvDAAO и выявлены аминокислотные остатки,обеспечивающиенековалентноесвязываниекофактора.Наоснованиикомпьютерного скрининга выбраны и изучены роли остатков Ala9, Ala12, Glu32 иPhe33 в температурной стабильности и каталитических свойствах TvDAAO спомощьюнаправленногомутагенеза.Оказалось,чтоэтиостаткииграютисключительно важную роль в структуре и функции TvDAAO. Замены остатковAla9 и Ala12, которые сами по себе не являются консервативными, но находятся ввосококонсервативной последовательности GXGXXG, привели к существеннойпотере температурной стабильности фермента.
В результате изучения остатковGlu32 и Phe33, которые располагаются рядом с окси-группами рибозы и адениновойчастью FAD, было показано, что введение неcкомпенсированных зарядов, а такжевведение гидрофильных замен, структурно отличающихся от исходных остатков вэтой области, приводят к сильной дестабилизации молекулы фермента. Прикомпенсации отрицательного заряда за счет введения двойной замены E32R/F33Dбыла получена мутантная TvDAAO E32R/F33D, которая обладает повышеннойтемпературной стабильностью и улучшенными каталитическими свойствами сбольшинством субстратов по сравнению с TvDAAO дикого типа.
Было показано,что эффект стабилизации вероятнее всего объясняется усилением связываниямолекулы FAD белковой глобулой TvDAAO. Стоит упомянуть, что двойная заменаE32R/F33D была выбрана на основе сравнения структуры FAD-связывающихдоменов TvDAAO и RgDAAO. Кроме того, полученные результаты свидетельствуето том, что аминокислотные замены вдали от каталитического центра TvDAAOмогут приводить к улучшению каталитических свойств фермента. Данный эффект,возможно, объясняется изменением конформации белка таким образом, чтовозрастает эффективность катализа. В пользу этого говорит небольшой росткаталитической активности со многими D-аминокислотами.Исходяизвышесказанного,намибылорешеноиспользоватьTvDAAO E32R/F33D в качестве основы для дальнейшего получения мутантныхTvDAAO с улучшенными свойствами вместо фермента дикого типа.2004.4.
Объединение точечных аминокислотных замен для полученияTvDAAO с улучшенными свойствамиВ настоящее время для снижения стоимости биокатализаторов, повышенияих операционной стабильности, уменьшения времени реакции, увеличения выходацелевого продукта и т.д., свойства ферментов оптимизируют с помощьюразличных методов белковой инженерии. Оксидаза D-аминокислот из дрожжейTrigonopsis variabilis не является исключением. В нашей лаборатории проводятсяработы по изучению структурно-функциональных взаимосвязей TvDAAO иполучение мутантных форм TvDAAO с улучшенными свойствами с помощьюрациональногодизайна.Однако,получениеферментасозначительноулучшенными свойствами является весьма сложной практической задачей.В течение последних лет в нашей лаборатории, помимо описанных в даннойработе, было получено около 30 мутантных форм TvDAAO с точечными идвойнымиаминокислотнымиповышеннойтемпературнойзаменами,некоторыестабильностью,изкоторыхувеличеннойобладаликаталитическойактивностью с рядом D-аминокислот, в том числе с цефалоспорином C.
В практикебелковой инженерии, как правило, задача получения мутантных ферментов соптимизированными свойствами под цели определенных биотехнологическихпроцессоврешаетсяпутемобъединениянесколькихуспешныхточечныхаминокислотных замен в многоточечные замены. Каждая из этих замен вотдельности может иметь умеренное или очень специфическое влияние насвойства фермента, в то время как многоточечный мутантный ферментприобретает совокупность желаемых свойств, например, значительно повышеннуюстабильность, каталитическую активность и т.д. [192].В связи с большим количеством полученных экспериментальных данных иопределеннымиуспехамизаключительнойглавывулучшениисвойствструктурно-функциональныхTvDAAO,исследованийврамкахTvDAAOстояла задача объединения наиболее успешных, с точки зрения влияния насвойства фермента, точечных аминокислотных замен в многоточечные мутантныеTvDAAO в различных комбинациях с целью усиления положительных эффектов.2014.4.1.
Выбор точечных аминокислотных замен для объединенияРанее в нашей лаборатории был получен ряд мутантных TvDAAO, которыеобладали улучшенными свойствами по сравнению с ферментом дикого типа. Срединих следует отметить мутантные ферменты с точечными аминокислотнымизаменами F54A, F54S, F54Y, S105A, C108F и мутанты с двойными заменамиF54A/C108F, F54S/C108F и F54Y/C108F. Среди полученных мутантных TvDAAO врамках данной работы наиболее интересными с точки зрения улучшения свойствбылимутантысзаменамиE32R/F33D,M104FиF54S/M104F.Можноконстатировать, что 32/33, 54, 104, 105 и 108 положения оказались наиболееинтересными и перспективными в структуре TvDAAO. Замены в этих положенияхпривели к следующим положительным изменениям в свойствах TvDAAO(подчеркиванием показаны замены полученные в данной работе):1.E32R/F33Dпривелаксущественномуповышениютемпературнойстабильности TvDAAO (в среднем в 3-4 раза), усилению связываниякофактора FAD белковой глобулой, а также к улучшению каталитическихсвойств со многими D-аминокислотами (см.
главу 4.3).2.F54S, F54A, F54Y привели к сужению спектра субстратной специфичность,увеличению каталитической активности с цефалоспорином С, однако в целомотрицательно повлияли на температурную стабильность фермента. ЗаменаF54A привела к полной дестабилизации TvDAAO. Комбинация этих трехзамен с заменой C108F позволила получить мутантные TvDAAO сповышенной активностью с цефалоспорином С, которые не уступали по своейтемпературной стабильности ферменту дикого типа [57].3.M104F привела к значительному повышению температурной стабильностиTvDAAO (более чем в 5 раз).
Каталитическая активность TvDAAO M104F сомногими D-аминокислотами была близка или превышала таковую дляфермента дикого типа, однако для большинства субстратов наблюдался ростзначений КМ (см. главу 4.1 и 4.2). Объединение с заменой F54S позволилополучить более узкоспецифичный фермент и повысить активность с частьюD-аминокислот при небольшой потери в температурной стабильности.2024.S105A привела к повышению температурной стабильности (в 1,5-2 раза) иулучшению каталитических свойств с некоторыми D-аминокислотами.5.C108F привела к повышению температурной стабильности (в среднем в 2раза), а также к небольшому улучшению каталитических свойств фермента снекоторымиD-аминокислотамиицефалоспориномС.МутантнаяTvDAAO С108F была успешно закристаллизована в нашей лаборатории,после чего впервые в мире была решена ее трехмерная структураразрешением 2,8 и 1,8Å [76].Положение описанных аминокислотных остатков в структуре TvDAAOпоказано на рис.
4.58. Все положения можно разделить на две пространственноразделенные группы. К первой группе относится замена E32R/F33D, котораянаходится в FAD-связывающем домене TvDAAO. Ко второй группе относятсязамены в 54, 104, 105 и 108 положениях, которые располагаются на входе вактивныйцентр(субстрат-связывающийдомен)фермента.Необходимоподчеркнуть, что остаток Phe54 и остатки Met104, Ser105, Cys108 расположены вразных элементах вторичной структуры TvDAAO и, как было показано в главе 4.2,остатки Phe54 и Met104 могут взаимодействовать между собой. Кроме того, стоитотметить, что 3 из 4 остатков (Met104, Ser105, Cys108), замены которых привели кповышениютемпературнойстабильностиTvDAAO,расположенывнеупорядоченной петле с 95 по 120 остаток. Гидрофобизация данногоструктурного элемента, по-видимому, приводит к повышению стабильностибелковой глобулы TvDAAO.
Роль данной соединительной петли в температурнойстабильности и каталитической активности TvDAAO была подробно изучена вглаве 4.1.203Рис. 4.58. Пространственное расположение остатков E32, F33, F54, M104, S105 и С108 в трехмерной структуре TvDAAO (слева показанорасположение остатков в FAD-связывающем домене, справа наверху – вид спереди на активный центр, справа внизу – вид изактивного центра).204Итак, поскольку замена E32R/F33D положительно повлияла как натемпературную стабильность, так и на каталитическую активность TvDAAO, тонами было решено использовать эту замену как основу для всех многоточечныхмутантов. Так как данная замена располагается вдали от активного центрафермента, мы можем ожидать аддитивность свойств при ее объединении с другимиаминокислотными заменами. Также было решено изучить влияние введения сразунескольких замен в соединительную петлю с 95 по 120 остаток на температурнуюстабильность TvDAAO.Такимобразом,намибыливыбраныследующиекомбинациидляобъединения:1.E32R/F33D + C108F (мутант М1)2.E32R/F33D + F54A + C108F (мутант М2)3.E32R/F33D + F54S + C108F (мутант М3)4.E32R/F33D + F54Y + C108F (мутант М4)5.E32R/F33D + M104F + C108F (мутант М5)6.E32R/F33D + S105A + C108F (мутант М6)7.E32R/F33D + M104F + S105A + C108F (мутант М7)8.E32R/F33D + M104F (мутант М8)9.E32R/F33D +F54S + M104F (мутант М9)Многоточечные замены М1-М4 выбраны с целью получения фермента сувеличеннойкаталитическойактивностьюиповышеннойтемпературнойстабильностью.
Замены М5-М7 образуются за счет объединения замены M1 cзаменами M104F, S105A и M104F/S105A, соответственно, с целью изучениявлияния введения нескольких замен в соединительную петлю 95-120 настабильность TvDAAO. Замена М8 является объединением замен E32R/F33D иM104F, которые привели к самому большому эффекту стабилизации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
