Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГОКРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВАХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиГОЛУБЕВИгорь ВладимировичСТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕИССЛЕДОВАНИЯ ДРОЖЖЕВОЙОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМРАЦИОНАЛЬНОГО ДИЗАЙНА03.01.04 – биохимия03.01.06 – биотехнология(в том числе бионанотехнологии)Диссертацияна соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:доктор химических наук,профессор В.И.
ТишковМосква – 2014ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................... 5I. ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................... 6II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................. 92.1. Оксидаза D-аминокислот .......................................................................................
92.1.1. История открытия, локализация и физиологическая роль .......................... 92.1.2. Первичная структура DAAO из различных источников ............................ 122.1.3. Трехмерная структура и механизм действия DAAO .................................. 182.2. Основные свойства DAAO из различных источников .....................................
262.2.1. Каталитические свойства .............................................................................. 272.2.2. Температурная стабильность ........................................................................ 302.2.3. Механизм термоинактивации ....................................................................... 312.3. Применение DAAO в биотехнологии................................................................. 352.3.1. Аналитическая биотехнология ..................................................................... 352.3.2. Тонкий органический синтез ........................................................................ 382.3.3.
Терапия различных заболеваний .................................................................. 422.3.4. Трансгенные растения ................................................................................... 452.4 Белковая инженерия DAAO ................................................................................. 472.4.1. Белковая инженерия DAAO из Sus crofa (pkDAAO) .................................. 482.4.2. Белковая инженерия DAAO из Homo sapiens (hDAAO) ............................ 512.4.3.
Белковая инженерия DAAO из дрожжейRhodotorula gracilis (RgDAAO) ................................................................... 512.4.4. Белковая инженерия DAAO из дрожжейTrigonopsis variabilis (TvDAAO)..................................................................
55III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................................................... 743.1. Материалы ............................................................................................................. 743.2. Методы исследования .......................................................................................... 7523.2.1. Рациональный белковый дизайн .................................................................. 753.2.2. Направленный мутагенез гена tvdaoo .......................................................... 753.2.3.
Электрофорез ДНК в агарозном геле ........................................................... 773.2.4. Выделение ДНК из агарозного геля ............................................................. 773.2.5. Рестрикция ДНК ............................................................................................. 783.2.6. Лигирование фрагментов ДНК ..................................................................... 783.2.7. Трансформация клеток E.coli ........................................................................
783.2.8. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.сoli ............................................ 793.2.9. Секвенирование ДНК .................................................................................... 803.2.10. Экспрессия TvDAAO в клетках E.coli ....................................................... 803.2.11. Выделение и очистка TvDAAO .................................................................. 813.2.12.
Белковый электрофорез в денатурирующих условиях ............................ 823.2.13. Определение концентрации фермента ....................................................... 833.2.14. Определение активности TvDAAO ............................................................
833.2.15. Определение каталитических параметров TvDAAO................................ 843.2.16. Изучение температурной стабильности TvDAAO ................................... 843.2.17. Математический аппарат теории диссоциативнойтермоинактивации ......................................................................................... 85IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ....................................................................
864.1. Роль остатка Met104 в каталитических свойствахи стабильности TvDAAO ..................................................................................... 864.1.1. Анализ трехмерной структуры TvDAAO и компьютерноемоделирование............................................................................................... 864.1.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами в 104 положении ................
924.1.3. Каталитические свойства мутантных TvDAAO с заменамив 104 положении ............................................................................................ 964.1.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменамив 104 положении .......................................................................................... 1064.1.5. Влияние замен Met104Glu и Met104Lys на свойства TvDAAO .............. 12034.1.6. Удаление соединительной петли с 99 по 110 остатокв структуре TvDAAO .................................................................................. 1284.2. Изучение взаимодействия между остатками в 54, 104 и 258 положениях ...
1374.2.1. Компьютерное моделирование замен в 54, 104 и 258 положениях ........ 1384.2.2. Получение мутантных TvDAAO с двойными заменамив 54/104 и 104/258 положениях ..................................................................
1404.2.3. Каталитические свойства мутантных TvDAAOс двойными заменами ................................................................................. 1444.2.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAOс двойными заменами ................................................................................. 1534.3. Оптимизация структуры FAD-связывающего домена TvDAAO .................. 1664.3.1. Анализ структуры FAD-связывающего домена TvDAAO.Компьютерное моделирование. ................................................................. 1674.3.2.
Получение мутантных TvDAAO с заменамив 9, 12, 32 и 33 положениях ........................................................................ 1764.3.3. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами вкофермент-связывающем домене .............................................................. 1834.3.4.
Изучение влияния замены E32R/F33D на связывание FAD .................... 1904.3.5. Каталитические свойства мутантных TvDAAO с заменамив кофермент-связывающем домене ........................................................... 1934.4. Объединение точечных аминокислотных замендля получения TvDAAO с улучшенными свойствами ................................... 2014.4.1. Выбор точечных аминокислотных замен для объединения .................... 2024.4.2. Получение мутантных TvDAAO с многоточечными заменами .............. 2064.4.3. Каталитические свойства многоточечных мутантных TvDAAO ............ 2104.4.4.
Температурная стабильность многоточечных мутантных TvDAAO ..... 215V. ВЫВОДЫ .................................................................................................................. 230VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................... 2324СПИСОК СОКРАЩЕНИЙFAD- флавинадениндинуклеотидDAAO- оксидаза D-аминокислотwt-TvDAAO- дикий тип оксидазы D-аминокислот из дрожжей TrigonopsisvariabilisTvDAAO- оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilisRgDAAO- оксидаза D-аминокислот из дрожжей Rhodotorula gracilispkDAAO- оксидаза D-аминокислот из почки свиньиhDAAO- оксидаза D-аминокислот из человекаApDAAO- оксидаза D-аминокислот из Arthrobacter protophormiaeCbDAAO- оксидаза D-аминокислот из дрожжей Candida boidiniiNMDA- N-метил-D-аспартатИПТГ- изопропил- -D-тиогалактопиранозидАБТС- 2,2`-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)БСА- бычий сывороточный альбуминКФБ- калий-фосфатный буферCPC- цефаллоспорин С7-АЦК- 7-аминоцефалоспорановая кислотаКА-7-АЦК- α-кетоадипил-7-аминоцефалоспорановая кислотаГЛ-7-АЦК- глутарил-7-аминоцефалоспорановая кислотаPDB- база данных белковых структур (Protein Data Bank)5I.
ВВЕДЕНИЕОксидазаD-аминокислот(DAAO,КФ1.4.3.3)относитсякклассуFAD- содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминированиеD-аминокислот в соответствующие α-кетокислоты. Этот фермент выполняетважные функции в живых организмах и находит все более широкое практическоеприменение в биотехнологии. В настоящее время выделяются два основныхнаправления по исследованию DAAO. Первое направление заключается в изучениифизиологической роли DAAO в организме человека (hDAAO) и поиске новыхингибиторовэтоголекарственныхфермента,препаратоввкоторыетерапиимогутцелогоприменятьсярядавкачественейродегенеративныхзаболеваний.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
