Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 6
Текст из файла (страница 6)
– нет данныхВ заключении хочется отметить, что наибольшую активность с важнымбиотехнологическимсубстратомцефалоспорином СпроявляютRgDAAO(КМ=4,0±0,5 мМ, kcat=73±7 с-1) и TvDAAO (КМ=2,4±0,4 мМ, kcat=72±8 с-1), чтообъясняет повышенный интерес к этим ферментам с точки зрения созданияэффективных биокатализаторов для окисления цефалоспорина С. В то же времяферменты из млекопитающих намного менее активны с цефалоспорином С,например, значение kcat для pkDAAO с этим субстратом составляет всего 0,65 с-1[71].292.2.2. Температурная стабильностьКак было отмечено выше, DAAO из термофильных микроорганизмов до сихпор не выделены и не изучены.
Среди всех изученных DAAO на данный моментнаиболее стабильным ферментом является TvDAAO – при 45°C сохраняет 100%активность при инкубации в течение 30 минут. Термоинактивация RgDAAOнаблюдается уже при температурах выше 30°С – за 30 минут при 45 °С ферментинактивирует полностью. Значения Тм (температура, при которой теряется 50%исходной активности после 30 минутной инкубации) для исследованныхпрепаратов pkDAAO, RgDAAO и TvDAAO составили 39ºС, 44ºС и 54ºСсоответственно (рН 8,0) [71]. ApDAAO и CbDAAO по термостабильности оченьсхожи с RgDAAO. Так при температурах > 30 °С ферменты начинаютинактивироваться, а при 50 °С полностью теряют активность за 30 минут [65,68].Для ApDAAO период полуинактивации при рН 7,6 и 40 оС составляет всего 21 мин[68], а для CbDAAO Тм составляет 37ºС [65].
При умеренных температурах DAAOможет подвергаться инактивации пероксидом водорода, который образуется врезультате катализируемой ферментом реакции. При 2х часовой инкубациифермента в 100 мМ пероксиде водорода наблюдается частичная инактивация [50].В случае TvDAAO причиной может служить окисление остатков Cys108, Cys298,Met156, Met209, Met226 и др [58–60].Стоит отметить, что концентрация ферментов влияет на их стабильноcть.Было показано, что при низких концентрациях RgDAAO (10-20 мкг/мл) такоевлияние практически отсутствует, но наблюдается при концентрациях 0,1÷3,5мг/мл [71]. Это выражается в значительном увеличении температуры Тм с 48 при0,1 мг/мл до 57°С при 3,5 мг/мл [50].
Другими авторами было показано, чтоснижение концентрации RgDAAO всего в три раза (с 0,15 до 0,05 мг/мл) приводитк уменьшению периода полуинактивации с 8 часов до 45 мин [75]. Эти данныеуказывают на то, что первым этапом процесса термоинактивации RgDAAO можетявлятся диссоциация фермента на отдельные субъединицы. В случае pkDAAOзависимости термостабильности от концентрации не наблюдается, посколькуинактивациямономернойpkDAAOи30димерныхRgDAAOиTvDAAO,по-видимому, протекает в соответствии с различными механизмами.
Интереснойявляется работа по переводу RgDAAO в мономерное состояние [48]. В результатестабильность фермента сильно снизилась - Тm уменьшилась на 6 градусов иперестало зависеть от концентрации фермента в диапазоне 0,1 – 3,5 мг/мл) [50].Стоит отметить, что при добавлении экзогенного FAD происходитстабилизация RgDAAO и TvDAAO при температурах > 40°С [35,71].
При 50°Спериод полуинактивации рекомбинантной TvDAAO увеличивается практически в 2раза при добавлении 100 мкМ экзогенного FAD (10-кратный избыток) к 10 мкМраствору фермента [35]. Данный феномен указывает на то, что диссоциация FADиз активного центра DAAO является одной из причин потери активности приповышенных температурах. Необходимо подчеркнуть, что приводимые авторами вработе [35] зависимости остаточной активности от времени для рекомбинантнойTvDAAO некорректно описываются простой экспоненциальной функцией.В нашей лаборатории была подробно изучена стабильность рекомбинантнойTvDAAO [76].
Стабильность TvDAAO при температурах 4°C, 25°C и 50-60°Cзависит от начальной концентрации фермента, а также фермент теряет около 5-7%активности при каждой заморозке-разморозке. Природа буфера незначительновлияет на стабильность TvDAAO, однако фермент наиболее стабилен в диапазонеpH = 7.0÷8.0. Период полуинактивации TvDAAO при 54°C составляет 38 минут.2.2.3.
Механизм термоинактивацииПодробное изучение кинетики и механизма термоинактивации TvDAAOявляется важным условием для выработки стратегии повышения температурнойстабильности этого фермента с помощью рационального дизайна. Данные отемпературной стабильности TvDAAO, описанные в литературе, являются весьмапротиворечивыми. Это в первую очередь связано с тем, что скоростьтермоинактивации зависит от начальной концентрации фермента. Наиболееподробное изучение механизм термоинактивации TvDAAO было проведено вработе [35] при 50°C. Для сравнения использовали модификацию TvDAAO, вкоторой остаток Cys108 окислен до сульфоновой кислоты. Авторами было31показано,чтозависимостиостаточнойактивностихорошоописываютсямоноэкспоненциальными функциями, однако стабильность ферментов повышаетсяс увеличение их начальной концентрации.
Авторы изучили процесс агрегации,влияние экзогенного FAD на стабильность TvDAAO, а также кинетику выделенияFAD в процессе инактивации TvDAAO. В результате была предложенакинетическая схема, которая включает три параллельно протекающих процесса –первый из них заключается в обратимой диссоциации кофактора FAD споследующей необратимой агрегацией, второй представляет собой необратимоеразворачивание белковой глобулы. Кроме того, возможен третий процесс –окисление остатка Cys108 у нативной TvDAAO, однако он не вносит большоговклада в общую скорость инактивации фермента при 50°C. Авторы отмечают, чтоглавной причиной инактивации TvDAAO является обратимая диссоциациикофактора с последующей необратимой агрегацией. Стоит отметить, что в даннойработебылииспользованыдостаточновысокиеначальныеконцентрацииферментов 1, 10 и 20 мкМ, что соответствует 40 мкг/мл, 0,4 мг/мл и 0,8 мг/мл.
Присамой низкой концентрации нативной и окисленной TvDAAO экспериментальныезависимости плохо описываются простой экспоненциальной функцией. Крометого, процесс инактивации изучался в 10мМ Трис-HCl pH 7.5 буфере, для которогозначение pH сильно зависит от температуры. Также авторы не учитываютвозможность изменения активности TvDAAO при различных концентрациях засчет образования олигомерных форм. Кроме того, предложенная модель процессаинактивацииплохоописываетданныеконцентрационнойзависимоститермоинактивации TvDAAO.В нашей лаборатории также было проведено подробное изучение механизматермоинактивации рекомбинантной TvDAAO при повышенных температурах вдиапазоне 50-60°C и различных начальных концентрациях фермента от 8 до 40мкг/мл [76]. Кроме того, механизм термоинактивации был изучен для рядамутантных форм TvDAAO [56,57].
Было показано, что зависимости остаточнойактивности от времени корректно описываются суммой двух экспоненциальныхфункций,чтобылоподтвержденос32помощьюкритерияФишера.Этосвидетельствует о протекании процесса инактивации фермента по крайней мере вдве стадии. В результате экспериментов было найдено две особенности процессатермоинактивации TvDAAO:1. Зависимости остаточной активности от времени в полулогарифмическихкоординатах при различных температурах и концентрациях фермента имелихарактерные изломы (т.е. два линейных участка).2. При фиксированной температуре скорость термоинактивации на раннейстадиипроцесса(первыйлинейныйучасток)независитотначальнойконцентрации, а при более глубокой степени инактивации скорость процессауменьшается при увеличении начальной концентрации фермента.Помимо этого, эксперименты показали, что на начальном линейном участкепроисходит полное восстановление активности фермента после прекращенияинкубации, что говорит об обратимости процесса термоинактивации прикратковременной термообработке.
На основании полученных данных был сделанвывод о том, что процесс термоинактивации рекомбинантной TvDAAO, а такжеряда ее мутантных форм, протекает по двухстадийному диссоциативномумеханизму (схема 1.1), который был описан в работах О.М. Полторака для рядадругих олигомерных белков [77–79]. Математическое описание данного механизмаприведено в пункте 3.2.17 раздела “Материалы и Методы”. Диссоциативныймеханизм термоинактивации, как правило, наблюдается в узком температурномдиапазоне, поскольку константа скорости диссоциации димера k1 и константаскорости инактивации мономера k2 по-разному зависят от температуры. В случаеTvDAAO при температуре выше 60°С стадия диссоциации димера на мономерыпротекаеточеньбыстро,искорость-лимитирующейоказываетсястадияинактивации мономеров, описываемая кинетикой реакции первого порядка.
Притемпературах ниже 50°С скорость-лимитирующей стадией является диссоциациядимерной формы TvDAAO. В диапазоне 50-60°С константы обеих стадийсравнимы между собой, что приводит к реализации диссоциативного механизма ипоявлению биэкспоненциальных зависимостей остаточной активности от времени.33Схема 2.1.
Механизм термоинактивации TvDAAO. ND – активный нативный димер, М –неактивный мономер, D – денатурированный мономер, k1 и k-1 – константыскорости диссоциации димера и ассоциации мономеров соответственно (Kdis =k1/k-1 – константа равновесия процесса диссоциации фермента), k2 – константаскорости инактивации мономеров.Стоит отметить, что при высоких концентрациях TvDAAO (выше 100мкг/мл) в начальный момент времени происходит активация фермента, чтоуказывает на более сложный механизм термоинактивации вследствие образованияассоциатов TvDAAO более высоких порядков, чем димер. Наличие форм ферментас более высокой степенью олигомеризации было показано с помощьюседиментационного анализа [76].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
