Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Стоит отметить,что DAAO может использоваться для терапии заболеваний, не связанных споражением нервной системы. Например, недавно было показано, что DAAOможет играть важную роль в антибактериальной системе у млекопитающих,например, фермент подавляет рост бактериальных клеток Staphylococcus aureus иразвитие инфекции [136].В заключение стоит подчеркнуть, что использование DAAO в терапии рака инейродегенеративных заболеваний имеет определенные ограничения, посколькуэтот фермент участвует в регуляции уровня различных D-аминокислот, которые, всвою очередь, могут участвовать в регуляции совершенно разных процессов ворганизме. Одним из возможных решений проблемы является использованиетканеспецифичнойгенотерапии.Этотподходзаключаетсявобразованиимутантной DAAO с необходимым профилем субстратной специфичности в строгоопределенных тканях.
В этом случае, при неизменном уровне биосинтезафермента, появляется возможность селективного влияния на уровень только однойопределенной D-аминокислоты. Реализация подобного подхода является важнойзадачей, которую необходимо решить в ближайшее время с помощью методовбелковой инженерии.442.3.4. Трансгенные растенияНаибольший вклад биотехнологии в сельское хозяйство связан с развитиемтрансгенных зерновых культур. Обычно трансгенные растения получают,комбинируя интересующий ген с геном, который определяет какой-либо полезныйпризнак, например, обеспечивает устойчивость к определенному гербициду. Впоследние годы, общественный взгляд относительно опасного горизонтальногопереноса генов устойчивости в окружающую среду стал толчком для изученияальтернативных селекционных систем; одна из наиболее интересных основана накаталитических свойствах DAAO.
Растения обладают ограниченной способностьюк метаболизму D-аминокислот: они быстро усваивают D-аминокислоты изокружающей среды, но клетки растений не обладают эндогенной активностьюDAAO, что замедляет рост [7]. Была создана трансгенная Arabidopsis thaliana,экспресссирующая RgDAAO. В результате такие растения превращают некоторыеD-аминокислоты в безвредные α-кетокислоты, что приводит к их росту [90].Поскольку природное содержание D-аминокислот невелико, гетерологическаяэкспрессия DAAO не приводит к аномалиям в развитии растений, что былоподтверждено при экспрессии TvDAAO в рисе [137].
Так экспрессия DAAO врастениях может быть использована для их селекции. При выращивании такогорастения на среде с D-аланином, оно будет расти быстрее, чем остальные.Например, на среде с D-серином были выращены трансгенные листья яблони Malusdomestica, в которых экспрессируется RgDAAO [58]. С другой стороны, обработкарастений, в которых экспрессируется ген daao, D-лейцином или D-валиномприводит к их гибели, поскольку сами по себе эти D-аминокислоты нетоксичны, апродукты их окислительного дезаминирования ядовиты [138]. RgDAAO вместе сL-глутамат аминотрансефарозой использовалась для получения пыльцы одногопола Nicotiana tabacum [139]. Глицин оксидаза из Bacillus subtilis используется дляполучения трансгенных растений с устойчивостью к различным гербицидам, такимкак N-глицинфосфат (дешевый и низкотоксичный для животных) [137,139,140],поскольку глицин оксидаза окисляет этот субстрат в неядовитый продукт.45В заключении данной главы хочется отметить, что свойства природныхферментовдалеконевсегдаявляютсяоптимальнымидлямногихбиотехнологических процессов и требуют оптимизации.
В этом случае DAAO неявляется исключением и одним из ограничений ее применения в биотехнологииявляется недостаточно высокая стабильность и каталитическая активность спромышленно-важнымисубстратами.Вторымосновнымпрепятствиемиспользования DAAO является дороговизна биокатализаторов, полученных на ееоснове.Такимобразом,длязаменыхимическихпроизводствнабиокаталитические, свойства природных DAAO должны быть оптимизированы подцели и задачи конкретного биотехнологического процесса. Кроме того, в связи сбыстрым развитием промышленности и сложностью оптимизации процессовполучения ферментов и биокатализаторов, а также непосредственно процессовпроизводства,впоследнеевремянаблюдаетсятенденциякразработкебиокатализаторов, которое могут применяться сразу в нескольких различныхбиотехнологических процессах [58]. Свойства природных DAAO могут бытьизменены и оптимизированы с помощью методов белковой инженерии, результатыприменения которых будут обсуждаться в следующей главе.462.4 Белковая инженерия DAAOСовременные методы генетической инженерии вместе с постояннорасширяющимися знаниями о взаимосвязи структуры и функции DAAO позволяютполучать мутантные формы фермента с требуемыми свойствами для каждойконкретной биотехнологической задачи – биосенсоры, катализ, медицина, сельскоехозяйство и т.д.
Причем это не ограничивает использование DAAO толькопромышленными процессами, а дает исследователям возможность поиска новыхперспективных областей ее применения. Работы по белковой инженерии DAAOнаправлены как на получение ферментов с заданными свойствами, так и наизучение функции тех или иных аминокислотных остатков. Можно с уверенностьюсказать, что наибольшее количество работ по изучению взаимосвязи структуры ифункции и направленному изменению свойств природных ферментов проделанодля RgDAAO. В первую очередь это объясняется тем, что дрожжевая RgDAAOявляется промышленно-важным ферментом, и ее структура была установленасравнительно давно (см. пункт 2.1.3). Значительно меньше изучены pkDAAO иTvDAAO.
Если pkDAAO представляла в основном теоретический интерес и неявлялась перспективной для применения на практике (последняя работа побелковой инженерии датирована 2006 годом), то TvDAAO является оченьперспективным ферментом для целей биотехнологии. Небольшое количество работпо мутагенезу TvDAAO, главным образом, объясняется тем, что для этогофермента долгое время отсутствовала трехмерная структура. В результате,различным авторам для работ по направленному мутагенезу приходилосьиспользоватьмодельныеструктурыTvDAAO,полученныеспомощьюкомпьютерного моделирования на основе рентгеноструктурных данных дляpkDAAO и RgDAAO. Однако данные модели не являлись достаточно точнымивследствие низкой гомологии между TvDAAO и RgDAAO (или pkDAAO).Ситуация изменилась, когда в 2008 году в нашей лаборатории была решенатрехмерная структура TvDAAO [4].
Это дало начало систематическим структурнофункциональным исследованиям TvDAAO.47В данной главе будут рассмотрены основные достижения в области белковойинженерии pkDAAO, hDAAO, RgDAAO и TvDAAO, которые систематизированы втаблице 2.4a-г.2.4.1. Белковая инженерия DAAO из Sus crofa (pkDAAO)Первые работы по белковой инженерии DAAO были начаты с pkDAAO в1991 году группой ученых из Японии [141], еще до того, как была установленапервая трехмерная структура этого фермента в 1996 году [31,32]. Было показано,что ряд остатков в структуре pkDAAO может подвергаться химическоймодификации с помощью различных реагентов. Например, остатки Tyr228 и His307модифицируются D-пропаргилглицином, что приводит к значительной потереактивности фермента.
Для изучения роли данных остатков в катализе и свойствахpkDAAO были получены мутанты с заменами Y228F и H307L. В результате обамутантных фермента проявляли более низкую каталитическую активность посравнению с диким типом, в случае замены Y228F наблюдался значительный ростKM (в 70 раз), а для H307L – рост константы диссоциации FAD (в 28 раз). Повидимому, обе замены вызывают конформационные изменения в структурефермента, влияющие на его каталитические свойства, однако роль данных остатковне была до конца выяснена.
Несколько позже в работе [142] был исследованкинетический механизм pkDAAO с помощью направленного мутагенеза остатковTyr224 и Tyr228 на остаток фенилаланина. Мутантные ферменты имелиспектральные характеристики такие же, как фермент дикого типа. Каталитическаяактивность мутанта с заменой Y224F с различными субстратами была близка ктаковой для дикого типа, тогда как мутант Y228F в среднем имел более высокиезначения KM и более низкую каталитическую активность. Оба остатка находятсявблизикактивномуцентруpkDAAOииграютважнуюфункциюввосстановительной полуреакции.
На этом исследование DAAO с помощьюнаправленного мутагенеза было временно прекращено, что, по-видимому, былосвязано с отсутствием трехмерной структуры DAAO, что существенно осложнялоинтерпретацию полученных результатов, а также сложность обоснования выбора48положений для введения мутаций и невозможность проведения экспериментов покомпьютерному моделированию. В тот период различные группы ученыхсконцентрировали свое внимание на экспериментах по кристаллизации DAAO,которые увенчались успехом в 1996 году, когда была закристаллизована pkDAAO ирешена ее трехмерная структура двумя независимыми группами исследователей изЯпонии и Италии (см.
пункт 2.1.3) [31,32]. Позже в 2000 году было решено сразу 3структуры RgDAAO. Эти достижения дали мощный толчок экспериментам побелковой инженерии RgDAAO (см. ниже). После установления структурыpkDAAO вышло всего три работы, поскольку фермент уже не представлялбольшого практического значения. В 2002 году вышла работа по изучениюкаталитической роли остатков Gly313 и Thr317.
При анализе трехмернойструктуры авторы выяснили, что карбонильная группа Gly313 ообразуетводородную связь с аминогруппой субстрата, а гидрокси-группа боковой цепиThr317 образует водородную связь с карбонильной группой изоаллоксазиногоцикла FAD (C(2)=O). Было показано, что Gly313 играет важную роль вмолекулярном узнавании – в результате замены G313A сильно увеличилисьзначения KM, понизилась каталитическая активность с большинством субстратов(D-Ala,D-Pro,D-Ser,D-Ile,D-Met)иизменилсяпрофильсубстратнойспецифичности. Мутант pkDAAO T317A имел более низкое сродство к FAD,каталитические свойства ухудшились в первую очередь за счет понижениякаталитической активности с D-Ala, D-Pro, D-Ser, D-Val, D-Phe.
Авторы показали,чтоThr317стабилизируетинтермедиатвокислительнойполуреакции,способствует диссоциации продукта из активного центра фермента и, такимобразом, играет ключевую роль во всем процессе катализа. Стоит отметить, чтоGly313 и Thr317 располагаются в активном центре фермента и являютсявысоконсервативными остатками (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
