Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 12
Текст из файла (страница 12)
В работеавторов из Китая [161] была построена модельная структура TvDAAO сцефалоспорином С в активном центре на основе структур pkDAAO (PDB: 1VE9) иRgDAAO (PDB: 1C0L). Авторы показали, что боковая группа остатка Phe54находится в 3Å от аминогруппы цефалоспорина С. Для выяснения роли этогоостатка в связывании цефалоспорина С и термостабильности фермента былиполучены мутантные TvDAAO с заменами F54A, F54S и F54Y.
Все полученныемутанты обладали увеличенной активностью с цефалоспорином С, по сравнению сферментом дикого типа (каталитическая константа увеличилась в случае заменF54A, F54S и F54Y в 2,7, 3 и 6 раз соответственно). Также оказалось, что всемутанты обладали более высокой температурной стабильностью, чем ферментдикого типа, особенно TvDAAO F54Y и F54A, которые не теряли активность при58инкубации в течение 1 часа при 55°С. В нашей лаборатории также было проведеноисследование роли остатка Phe54 в каталитических свойствах и стабильностиTvDAAO с помощью аналогичных аминокислотных замен [57]. Проведенноекомпьютерное моделирование и докинг цефалоспорина С в активный центрфермента показали, что остаток Phe54 взаимодействует с молекулой субстрата. Врезультате замены F54S была повышена каталитическая активность с объемнымиD-аминокислотами (D-Trp, D-Tyr, D-Phe, D-Leu) и достигнуто сужение спектрасубстратной специфичности за счет отсутствия активности с небольшимисубстратами.
Мутантные ферменты обладали повышенной активностью сцефалоспорином С. Однако данные по температурной стабильности отличались отданных работы [161]. В нашем случае замена F54A привела к сильнойдестабилизации TvDAAO и мутантный фермент выделить не удалось, в то времякакмутантнаяTvDAAOF54Yобладаланемногоболеевысокойтермостабильностью, чем фермент дикого типа. В другой нашей работе былопродолжено изучение роли аминокислотных остатков на входе в активный центрTvDAAO [56]. Был выявлен конформационно подвижный остаток Phe258 ипроведена его замена на остатки Ala, Ser и Tyr. Замена F258Y привела кпонижению активности с большинством субстратов, а замены F258A и F258Sвызвали резкое сужение профиля субстратной специфичности – увеличиласьактивность с D-Tyr, D-Phe и D-Leu и сильно снизилась с остальными субстратами.Однако обе замены отрицательно сказались на температурной стабильности, в товремя как мутант TvDAAO F258S был немного стабильнее фермента дикого типа.Полученные данные свидетельствует о важной роли остатков на входе в активныйцентр фермента в стерическом контроле и связывании субстратов.
Подобныеработы представляют собой большой практический интерес с точки зренияполучения мутантных TvDAAO с новыми каталитическими свойствами, посколькутакие ферменты могут быть использованы для различных целей биотехнологии,органического синтеза и аналитическом определении D-аминокислот.59Таблица 2.4аБелковая инженерия pkDAAO, hDAAO, RgDAAO и TvDAAO.АминокислотнаяЦель мутагенезаЭкспериментальный результатзаменаpkDAAOВ случае замены Y228FKM c D-Ala увеличилась в 70 раз,Vm уменьшилась в 1,5 раза,константа ингибированиябензоатом выросла в 1200 раз,Исследование ролиY228FKd(FAD) выросла в 1,4раза.остатков в катализеH307LДля H307L KM c D-AlaTyr228 и His307 [141]увеличилась в 10 раз, Vmуменьшилась в 1,7 раза, константаингибирования бензоатом вырослав 18 раз, Kd(FAD) выросла в 28раза.Исследование механизмадействия pkDAAO спомощью мутагенезаостатков Tyr224 и Tyr228[142]Y224FY228FДля мутанта Y224F спектральныеи кинетические свойствасоответствуют таковым дляфермента дикого типа.Для мутанта Y228F спектральныехарактеристики аналогичнытаковым для фермента дикоготипа.
Величина kcat с рядомсубстратов значительноухудшилась (в 2,5-8 раз). Дляобоих мутантов исследованкинетический изотопный эффект.60Вывод о роли исследуемогоостаткаОстаток Tyr228 участвует всвязывании субстратов и играетвторостепенную роль в связыванииFAD.Остаток His307 участвует всвязывании FAD и играетвторостепенную роль в катализе.Обе мутации приводят кдестабилизации переходногосостояния (в случае Y228F эффектболее значительный). ГидроксилTyr228 образует водородную связьс карбоксилом субстрата истабилизирует отрицательноепереходное состояние. Tyr224стабилизирует комплекс спереносом заряда, взаимодействуяс NH2+-группой. Таким образом,оба остатка играют важную роль вкатализе.G313AT317AДля мутанта G313Aуменьшилась активность иувеличились значения KM с D-Ala,D-Pro, D-Ser, D-Ile, D-Met иизменился профиль субстратнойспецифичности.В случае замены T317Aухудшилось связывание FAD икаталитические свойства с D-Ala,D-Pro, D-Ser, D-Val, D-Phe.Повышениетемпературнойстабильности с помощьюнеупорядоченногомутагенеза [143]F42CN246GN246EN246FN246YДля F42C повышенатермостабильность на 10 ºС.
Через1 ч инкубации при 55 ºС вприсутствии 1 мМ FAD мутантсохраняет около 80% исходнойактивности, pkDAAO дикого типа– 10%. Спектр субстратнойспецифичности не изменился.Мутанты в 246 положенииобладали немного более высокойтермостабильностью, но болеенизкой активностью, чем дикийтип.Инженерия субстратнойспецифичности, [144]участок I215-N225pkDAAO замененна R216-G220hDDOКаталитическая эффективность поD-Ala ниже в 390 раз, мутантпроявляет высокую активность сD-Asp, который не являетсясубстратом pkDAAO.Исследованиекаталитической иструктурной ролиостатков Gly313 иThr317[162]61Остаток Gly313 участвует враспознавании субстрата, образуяводородную связь карбонильнойгруппой с аминогруппой субстратаи, таким образом, определяетпрофиль субстратнойспецифичности фермента.
ОстатокThr317 стабилизирует интермедиатв процессе окислительнойполуреакции, способствуетвысвобождению продукта изактивного центра, играет важнуюроль во всем процессе катализа.Неупорядоченный мутагенезпозволяет найти перспективныеположения для исследования идобиться существенногоповышения стабильности.Образование внутри- имежмолекулярной дисульфиднойсвязи было исключено из-заудаленности остатка Phe42 отостатков Cys в структуре pkDAAO.Механизм стабилизации невыяснен и требуетдополнительных исследований.Последовательность Ile215-Asn225играет важную роль враспознавании субстратов. Заменаэтой последовательности наArg216-Gly220 hDDO позволяетполучить мутант со спектромсубстратной специфичности,близким к hDDO.E220D/Y224GR221D/Y224GG222D/Y224GI223D/Y224GY224DЗа счет значительного снижениявеличины KM каталитическаяВведение дополнительного “-”эффективность первых трехзаряда в короткий участокмутантов с D-Arg повышена вGlu220-Tyr224 и изменение объема1,5-8,3 раза.
Все мутантыполости позволяет значительнопрактически потеряли активность сповысить каталитическуюD-Ala и D-Ser, а также сильноэффективность pkDAAO с D-Arg.снизилась активность с D-Pro иD-Val.Таблица 2.4бЦель мутагенезаАминокислотнаязаменаЭкспериментальный результатВывод о роли исследуемогоостаткаhDAAOКовалентное связываниеFAD [145]G281CПолучена форма фермента, вкоторый 8-метилсульфонил FADсвязан ковалентно.
Мутантныйфермент с ковалентно связаннымFAD имеет активность на 26%выше, чем фермент дикого типа.62Ковалентно связанный FAD имеетправильную пространственнуюориентацию и эффективноработает в ходе катализа. Приэтом, однако, структура ферментаизменяется и становится болеежесткой, что вызывает ухудшениекаталитических свойств.Таблица 2.4вЦель мутагенезаАминокислотнаязаменаЭкспериментальный результатВывод о роли исследуемого остаткаRgDAAOВлияние трипептида наС-конце на числоизоформ и транспорт впероксисомы [146]Изучение роли консервативного Tyr223 всвязывании субстрата икатализе [150]Удален трипептидSerLysLeu с С-концаКинетические параметры итермоcтабильность не изменились.Количество изоформ уменьшилосьс 3 для RgDAAO дикого типа до 1(pI=7,2) для мутанта.
Транспортфермента в пероксисомыневозможен.Y223FКинетические свойства мутанта ифермента дикого типа идентичны.Y223SСвязывание субстрата в 60 размедленнее и в 800 раз сниженаскорость высвобождения продукта.Исследование ролиArg285 в ориентированиии связывании субстрата[149,151]R285QR285DR285KR285AИзучение роли Tyr238 вкатализе [152,153]Y238FЗамены приводят к резкомуухудшению и KM (300 раз), и kcat(500 раз). Спектральные свойствамутантов не изменились, ностепень стабилизацииполухиноновой формы флавинового кольца ниже, чем дляфермента дикого типа.Эффективность связываниябензоата натрия зависит от рН. В63Трипептид –SerLysLeu являетсясигнальной последовательностьютипа I, отвечающей за транспортфермента в пероксисомы.Существование RgDAAO дикоготипа в виде трех изоформопределяется наличием илиотсутствием трипептида на С-концеодной или двух субъединиц.Бензольное кольцо Tyr223 играетважную роль в связываниисубстрата.
Остаток фиксируетсубстрат в оптимальной дляэффективного катализа ориентации(стерический фактор иэлектростатические и водородныесвязи).Arg285 принимаетнепосредственное участие вкатализе – играет важную роль встабилизации отрицательногозаряда в N(1)-C(2)=O локусеизоаллоксазинового цикла FAD.Конформация остатка изменяетсяпри связывании субстрата.Остаток оказывает слабое влияниена связывание лиганда в активномY238SM213RИнженерия субстратнойспецифичности,повышение активности сD-Asp и D-Glu [54]M213R/Y238Rиз петли удалены 14остатковSer308-Lys321Исследование влиянияпетли Pro302-Glu322 надимеризацию [48,49]из петли удалены 5аминокислотныхостатковLys307-Ser311зависимости от субстрата боковаяцепь Tyr238 находится в различныхположениях.В реакции с D-Asp kcat возросла в 8раз, а значение Км снизилось в 10раз.
Величина kcat/Км с D-Glu в 37раз выше.Величина kcat/Км в два раза ниже,чем для мутанта Met213Arg.Каталитическая эффективностьобоих мутантов с другимисубстратами значительноухудшилась.Оба полученных мутанта являютсямономерами. Кинетическиесвойства в обоих случаяхизменились незначительно,KD(FAD) увеличилась в 5 раз. Дляобоих мутантов наблюдаетсяпониженная стабильность привысоких температурах. Мутант судаленными Lys307-Ser311подвержен протеолизу значительносильнее, чем другой мутант ифермент дикого типа.64центре.
Однако конформационныеизменения боковой цепи могутиграть важную роль в катализе.Введение дополнительных одногоили двух положительных зарядовобеспечивает более эффективноесвязывание карбоксильных групп.Каталитическая эффективностьточечного мутанта с D-Asp и D-Gluне уступает таковой для DASPO изпочки быка.Петля Pro302-Glu322 обеспечиваетпрочный контакт междусубъединицами. Олигомерноесостояние не влияет накинетические свойства, однакооказывает значительноеотрицательное действие настабильность фермента поддействием денатурантов ипротеолитических агентов.Невысокая протеолитическаястабильность мутанта судаленными Lys307-Ser311обусловлена тем, что часть петлиSer311-Lys321 экспонирована враствор и подвержена действиюпротеолитических ферментов.Изучение роли Ser335 вкатализе [154]S335GQ144RL118HИнженерия субстратнойспецифичности(неупорядоченныймутагенез) [104,105]D242V/Q253Arg/D304VT60A/Q144R/K152EQ144R/G199D/Y223CH329RИсследование ролиTrp243 вмежсубъединичныхконтактах, связыванииFAD и стабильности[155]W243YW243IКинетические и спектральныехарактеристики фермента неизменились.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
