Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 14
Текст из файла (страница 14)
ЗаменыF258A и F258S привели кпонижению, а F258S кнебольшому повышениютермостабильности.71Анализ литературных данных свидетельствует, что оксидаза D-аминокислотявляется очень важным ферментом как с точки зрения физиологической роли ворганизме человека, так и с точки зрения фундаментальных исследованийструктуры, механизма действия, стабильности, выступая в качестве модельногофермента для целого класса FAD-зависимых оксидоредуктаз. Кроме того, запоследние 30 лет дрожжевые RgDAAO и TvDAAO нашли применение в различныхобластяхбиотехнологии.Однакоосновныеограничениясвязаныснеоптимальными свойствами природных ферментов.
Структура RgDAAO сталадоступна в 2000 году, после чего было выполнено большое количество работ понаправленному изменению свойств фермента с помощью белковой инженерии, нони один из полученных мутантов не пригоден для эффективного промышленногоприменения и по своим свойствам, особенно по температурной стабильности, непревосходят рекомбинантную TvDAAO. Несмотря на то, что TvDAAO изначальноявляется самой перспективной DAAO для практического применения, посколькуобладает самой высокой температурной стабильностью, проявляет наибольшуюактивность к природному антибиотику цефалоспорину С и многим гидрофобнымD-аминокислотам, работы по белковой инженерии практически не проводилисьдля этого фермента, что было связано, в первую очередь, с отсутствием еготрехмерной структуры.
Для успешного применения TvDAAO в созданиибиосенсоров для селективного определения D-аминокислот и биокатализаторов длябиокаталитических процессов, которые способны вытеснить существующиехимические способы производства важных субстратов (7-АЦК, α-кетокислоты,неприродные L-аминокислоты и т.д.), необходимо проведение оптимизациисвойств природного фермента – увеличение каталитической активности сD-аминокислотами и цефалоспорином С, повышение температурной стабильностии сужение спектра субстратной специфичности. Для этих целей, начиная с 2008года, мы используем метод рационального белкового дизайна, который основан наподробном сравнении первичных и четвертичных структур гомологичных DAAO,нахождении структурных отличий, компьютерном моделировании, молекулярномдокинге и т.д. Данный метод показал свою эффективность в наших предыдущих72работах [51,56,57,163,164].
Тем не менее, для успешного применения методарационального дизайна, кроме наличия трехмерной структуры, необходимыбольшое количество экспериментальных данных о взаимосвязи структуры ифункции интересующего фермента. Как было показано в обзоре литературы, наданный момент количество подобных исследований по белковой инженерииTvDAAO, в отличие от RgDAAO, весьма ограничено.В данной работе планируется проведение систематических исследований,направленных на фундаментальное изучение структуры TvDAAO и выявленияновыхструктурно-функциональныхвзаимосвязей,атакжевыполнениеэкспериментов по направленному изменению свойств природного ферментаметодом рационального белкового дизайна.73III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ3.1.
МатериалыДля генно-инженерных экспериментов использовали реактивы марки“Molecular Biology Grade”, вода была очищена на установке MilliQ (“Millipore”,США). В микробиологических экспериментах использовали дрожжевой экстракт,бактотриптон и агар (“Difco”, США), глицерин (99,9%, “ultra pure”), хлорид натрия“ultra pure”, гидрофосфат калия, лизоцим (“Fluka/BioChemika”, Швейцария),хлоридмагнияихлоридкальция“ultrapure”(“Merck”,Швейцария),изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ), рибофлавин, хлорамфеникол, тетрациклини канамицин (“Sigma”, США), дигидрофосфат натрия “ч.д.а.”, глюкозу (“РеаХим”,Россия). Pfu-ДНК полимеразу, эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигазу фага Т4фирмы “Thermo Scientific” (Литва) использовали для направленного мутагенеза иклонирования фрагментов ДНК.
Олигонуклеотидные праймеры для проведенияполимеразной цепной реакции (ПЦР) были синтезированы на заказ фирмой“Синтол” (Россия).Для культивирования клеток E. coli использовали модифицированную среду2YT (16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1,5 г/л дигидрофосфатанатрия, 1 г/л хлорида натрия, 1 г/л гидрофосфата калия, рН 7,5).Для трансформации и экспрессии плазмид использовали следующиештаммы E.coli:E.coli DH5α: fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus: B F– ompT hsdS(rB- mB-) dcm+ Tetr galλ(DE3) endA Hte [pLysS argU ileY leuW Camr].Для электрофореза белков использовали реактивы, произведенные фирмой“Bio-Rad” (США). Для очистки и изучения свойств фермента применяли Трис-HCl(трис(гидроксиметил)аминометангидрохлорид)фирмы“Merck”(Германия),рацематы аминокислот фирмы “РеаХим” (Россия) и “Reanal” (Венгрия), 2,2`-азинобис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)АБТС74(“ДиаМ”,Россия),флавинадениндинуклеотид (FAD) фирмы “Sigma” (США) и пероксидазу из корнейхрена (“ДиаМ”, Россия).3.2.
Методы исследования3.2.1. Рациональный белковый дизайнПоиск последовательностей DAAO из различных источников проводили побазам данных KEGG GENES, SwissProt, GeneBank и IMBL с помощью программыtBLASTn по ключевому слову D-amino acid oxidase. В качестве исходнойиспользовалиизвестнуюаминокислотнуюпоследовательностьTvDAAO.Выравнивание аминокислотных последовательностей было выполнено с помощьюпрограммы CLUSTAL X 1.83.
Моделирование мутантных TvDAAO, наложениетрехмерных структур, получение изображений пространственной структурыфермента проводили с помощью пакета программ Accelrys Discovery Studio 2.5(Accelrys Inc., San Diego, CA, USA). При расчетах использовали силовое полеCVFF. Использовали не менее 500 циклов оптимизации.
Докинг субстратов вактивный центр TvDAAO выполняли с помощью молекулярного графическогоредактора Viewer программного комплекса Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA,USA).3.2.2. Направленный мутагенез гена tvdaooНаправленный мутагенез в гене tvdaao проводили с использованиемполимеразной цепной реакции (ПЦР) на приборе “Терцик” (“ДНК-технология”,Россия).
В качестве матрицы использовали плазмиду pTvDAAO, которая быларанее получена из коммерчески доступной плазмиды pET-33b(+) (“Novagen”,США), в которую по сайтам рестрикции NcoI и XhoI был встроен ген tvdaao изTrigonopsis variabilis. В плазмиде pTvDAAO ген tvdaao находится под контролемсильного промотора РНК-полимеразы фага Т7.Для введения мутации в ген tvdaao проводили полимеразную цепнуюреакцию с использованием прямого праймера на начало (T7_For) и обратного75праймера (T7_Rev) на конец гена, а также прямого (Mfor) и обратного (Mrev)праймеров, несущих требуемые мутации в гене tvdaao.T7_For5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’T7_Rev5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом0,5 мл (“Eppendorf”, Германия).
Пробирку прогревали в течение 5 мин при 95 ºС изатем проводили реакцию ПЦР с использованием следующей программы: 1-ястадия - 95 ºС, 30 с; 2-стадия - 56 ºС, 60 с и 3-я стадия - 72 ºС, 2 мин, всего 25-35циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72 ºС.Температуру на второй стадии выбирали на 3-5 градусов ниже температурыплавления дуплексов (Тm), образуемых праймерами. Для определения Тmиспользовали эмпирическую формулу:Tm 2 (n A nT ) 4 (nG nC ) ,где nx – количество нуклеотидов типа X в праймере.Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала 2,5 мкл 10-кратногоPfu-буфера для Pfu ДНК-полимеразы (исходные концентрации: 200 мM Трис-HCl(pH 8,8 при 25°C), 100 мM (NH4)2SO4, 100 мM KCl, 1 мг/мл БСА, 1% (об.) ТритонX-100, 20 мМ MgSO4.); 2,5 мкл смеси dNTP (dATP, dGTP,dTTP, dСTP,концентрация 2,5 мM каждого); 1 мкл ДНК-матрицы с концентрацией ≈ 10 нг/мкл;по 2 мкл праймеров For и Mrev (или Mfor и Rev), концентрация 10 пмоль/мл(“Синтол”, Россия); 0,5 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 Ед/мкл, “Thermo Scientific”)и деионизованную воду, общий объема смеси составлял 25 мкл.
Дляпредотвращения испарения реакционной смеси в пробирку добавляли 30 мклминерального масла.Для получения фрагментов, содержащих требуемую замену, проводили двеПЦР с использованием пар праймеров T7_For/Mrev (фрагмент 1) и Mfor/T7_Rev(фрагмент 2). Продукты ПЦР, фрагмент 1 и фрагмент 2, очищали из 1% агарозногогеля.
Затем проводили третью, объединяющую ПЦР с праймерами T7_For иT7_Rev, где в качестве ДНК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1и 2. Продукт объединяющей ПЦР очищали в агарозном геле и обрабатывали76уникальными эндонуклеазами рестрикции. Затем полученные фрагменты ДНКочищали и лигировали в ДНК-вектор, полученный из плазмидой pTvDAAO послеобработки теми же рестриктазами. Реакционной смесью после лигированиятрансформировали компетентные клетки E.coli DH5α. Секвенирования гена tvdaaoпроводили с использованием праймеров T7_For и T7_Rev.3.2.3.
Электрофорез ДНК в агарозном гелеЭлектрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в Трис-ацетатном буфере(40 мM Трис, 20 мM уксусная кислота, 1 мM ЭДТА, pH 8,5) при напряженностиэлектрического поля 2-3 В/см. Агарозный гель содержал бромистый этидий вконцентрации 1 мкг/мл. Визуализацию ДНК проводили на УФ-трансиллюминаторепри длине волны 254 или 312 нм.3.2.4. Выделение ДНК из агарозного геляПосле проведения препаративного ДНК-электрофореза в 1% агарозном геленужные полосы с фрагментами ДНК (после ПЦР или рестрикции) вырезали из геляпри освещении УФ-светом на длине волны 312 нм. Куски геля помещали впластиковые пробирки на 1,5 мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
