Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 17
Текст из файла (страница 17)
На рис. 4.1 данная петля выделенакрасным цветом, а дополнительный участок в структуре TvDAAO выделен синимцветом. Данное структурное отличие на примере TvDAAO и RgDAAO показано нарис. 4.2.86АБВГРис. 4.1. Трехмерные структуры pkDAAO (А), hDAAO (Б), RgDAAO (В) и TvDAAO (Г).Молекула FAD показана в CPK. Красным цветом выделена соединительнаяпетля в области активного центра. Синим цветом показан участок петли вструктуре TvDAAO, отсутствующий у других DAAO.87Рис. 4.2.
Наложение структуры RgDAAO (1C0P, выделена желтым) на структуруTvDAAO (выделена зеленым), RMSD = 1,27Å, количество совпадающихаминокислотных остатков – 286 из 356. Петля в области активного центраRgDAAO и TvDAAO выделена красным и синим цветом соответственно.Анализ множественного выравнивания DAAO из различных источников вобласти активного центра показал, что более чем 90% последовательностей DAAO(в том числе pkDAAO, hDAAO и RgDAAO) в отличиеот TvDAAO имеют разрыв вданной области (рис. 2.2).Таким образом, петля с 95 по 120 аминокислотный остаток в структуреTvDAAO может играть важную роль в поддержании стабильности TvDAAO,например, за счет экранирования активного центра фермента от растворителя и засчет взаимодействия с соседними элементами вторичной структуры.
Посколькуданная петля частично формирует вход в активный центр фермента, то отдельные88аминокислотные остатки, входящие в нее, могут играть важную роль в связываниисубстратов, каталитической активности, а также в стабильности TvDAAO.Рис. 4.3. Активный центр TvDAAO и расположение остатка Met104.Для поиска таких аминокислотных остатков, был проведен анализ строенияактивного центра TvDAAO и участка соединительной петли с 99 по 110 остаток,который отсутствует у других DAAO. В результате нами был выявлен остатокMet104, который располагается на изгибе вышеупомянутой петли на входе вактивный центр фермента и не принимает непосредственного участия в процессекатализа (рис.
4.3) Данный остаток является конформационно подвижным иприсутствует в кристаллической структуре в двух конформациях. Стоит отметить,что на входе в активный центр TvDAAO также располагаются два остатка Phe54 иPhe258, последний из которых также имеет две возможные конформации. Оба этихостатка были изучены нами ранее и была показана их важная роль в свойствахTvDAAO: замены в обоих положениях приводили к сужению спектра субстратнойспецифичности,увеличениюактивностисобъемнымигидрофобнымиD-аминокислотами и цефалоспорином С, однако отрицательно сказывались настабильности TvDAAO [56,57].
Таким образом, остаток Met104 может играть89важнуюрольвкаталитическихсвойствахистабильностифермента,взаимодействуя с субстратами при их связывании в активном центре и экранируяактивный центр от растворителя. Исходя из всего вышеописанного, нами былорешено изучить влияние замен остатка Мet104 на каталитические свойства итемпературную стабильность TvDAAO.Поскольку остаток Мet104 расположен на входе в активный центр, намибыли выбраны аминокислотные замены, которые имеют различный объем, форму игидрофобность, а также замены, несущие положительный и отрицательный заряд.Как было отмечено выше, в районе остатка Met104 в TvDAAO в большинствеаминокислотных последовательностей имеется разрыв (рис.
N). Исключениемявляются шесть наиболее эволюционно близких последовательностей DAAO, пятьиз которых имеют остаток Phe (ферменты из F. solani, A. niger, A. flavus, A. oryzae,C. posadasii) и одна имеет остаток Leu (фермент из N. crassa) в соответствующемположении. Нами было проведено компьютерное моделирование структурымутантных TvDAAO с различными заменами в 104м положении. В качествепримера на рис. 4.4 представлен активный центр фермента дикого типа имодельные структур мутантных TvDAAO с заменами M104A и M104F. ОстатокMet104 может взаимодействовать с остатками Phe54 и Phe258, посколькунаходится на расстоянии 4,5Å от них и является конформационно-подвижным. Изрис. 4.4 хорошо видно, что при введении замены M104A активный центр ферментастановится более открытым и доступным растворителю, а также пропадаютстерические препятствия, которые возможны при связывании объемных субстратовв активном центре фермента.
Обратная картина наблюдается при введении заменыM104F. Активный центр сильнее экранирован от доступа растворителя, при этомвозможны взаимодействия Phe104 с соседними остатками Phe54 и Phe258. Однакодополнительные стерические препятствия могут отрицательно сказаться накаталитических свойствах фермента с объемными субстратами.90A1A2A3Б1Б2Б3В1В2В3Рис. 4.4. Компьютерное моделирование замен остатка M104 в структуре TvDAAO.Активный центр TvDAAO дикого типа (А), TvDAAO M104A (Б), TvDAAO M104F(B).
1 – вид спереди на активный центр, 2 – вид из активного центр, 3 – видспереди, голубым цветом показана поверхность доступная растворителю.Таким образом, в результате подробного анализа структуры TvDAAO,множественного аминокислотного выравнивания последовательностей DAAO изразличных источников и компьютерного моделирования было выбрано 10аминокислотных замен остатка Met104 на остатки Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr,Trp, Glu и Lys.914.1.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами в 104 положенииНаправленныймутагенезостаткаMet104проводилиспомощьюполимеразной цепной реакции (см.
пункт 3.2.2). Для введения мутаций в ген daaoиспользовали универсальные олигонуклеотидные праймеры на начало и конецучастка гена соответственно:T7_For5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’T7_Rev5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’а также соответствующие прямой (Mfor) и обратный (Мrev) праймеры, несущиетребуемые замены в гене tvdaao (табл. 4.1).Фрагменты генов, полученные с помощью ПЦР, очищали в 1% агарозномгеле (см.
пункты 3.2.3, 3.2.4), обрабатывали рестриктазами NcoI и Bsp119I (AsuII)(см. пункт 3.2.5) и лигировали в плазмидный вектор pTvDAAO (см. пункт 3.2.6), изкоторогоспомощьютехжерестриктазпредварительнобылудаленсоответствующий фрагмент без мутации. Реакционной смесью, полученной послепроведения реакции лигирования, трансформировали клетки E.coli DH5α и клеткивысевали на чашки Петри с твердой агаризованной средой 2YT, содержащей 30мг/мл канамицина (см. пункт 3.2.7). С каждой чашки брали по 3 колонии ивыделяли из них плазмиды (см.
пункт 3.2.8), которые затем были использованы длясеквенирования гена tvdaao по обеим цепям. На основе секвенирования былиотобраны те плазмиды, которые содержали только необходимые замены в 104мположении и не имели других посторонних мутаций (см. пункт 3.2.9).Плазмидами, которые содержат мутации в гене tvdaao, соответствующеезаменам в 104м положении, трансформировали компетентные клетки E.coli BL21(DE3) pLysS Codon Plus. Затем было проведено культивирование клеток E.coli иэкспрессия мутантных TvDAAO и фермента дикого типа согласно методике,оптимизированнойвнашейлабораториикультивирования представлены в таблице 4.2.92(см.пункт 3.2.10).РезультатыТаблица 4.1.Олигонуклеотидные праймеры для введения мутаций в ген tvdaao в положение,соответствующее 104 остатку в структуре TvDAAO.ЗаменаНуклеотидная последовательность*Исходнаяпослед-тьM104AM104SM104VM104IM104LM104FM104YM104WM104EM104KFor5’– AA GGT GCC ATG TCG GCC ATC TGT CAA CGC AAC –3’Rev5’– TTG ACA GAT GGC CGA CAT GGC ACC TTC CAG TTT AGGAAG A –3’Mfor5’- AA GGT GCC GCG TCG GCC ATC TGT CAA CGC AA -3’Mrev5’- AT GGC CGA CGC GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG AT -3’Mfor5’- GAA GGT GCC AGT TCG GCC ATC TGT CAA CGC AAC -3’Mrev5’- CA GAT GGC CGA ACT GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG AT-3’Mfor5’- GAA GGT GCC GTG TCG GCC ATC TGT CAA CGC A -3’Mrev5’- A GAT GGC CGA CAC GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG AT-3’Mfor5’- GAA GGT GCC ATC TCG GCC ATC TGT CAA CGC AAC -3’Mrev5’- CA GAT GGC CGA GAT GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG AT-3’Mfor5’- TG GAA GGT GCC TTG TCG GCC ATC TGT CAA CGC -3’Mrev5’- ACA GAT GGC CGA CAA GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAGAT -3’Mfor5’- GAA GGT GCC TTC TCG GCC ATC TGT CAA CGC AAC -3’Mrev5’- ACA GAT GGC CGA GAA GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAGAT -3’Mfor5’- GAA GGT GCC TAC TCG GCC ATC TGT CAA CGC AAC -3’Mrev5’- ACA GAT GGC CGA GTA GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAGAT -3’Mfor5’- GAA GGT GCC TGG TCG GCC ATC TGT CAA CGC A -3’Mrev5’- A GAT GGC CGA CCA GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG AT-3’Mfor5'- GAA GGT GCC GAG TCG GCC ATC TGT CAA CGC -3'Mrev5'- GAT GGC CGA CTC GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG -3'Mfor5'- G GAA GGT GCC AAG TCG GCC ATC TGT CAA CGC -3'Mrev5'- CA GAT GGC CGA CTT GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG 3'* Подчеркиванием показан исходный кодон, соответствующий Met104.
Полужирнымшрифтом выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутации.93Все мутантные TvDAAO с заменами в 104м положении и фермент дикоготипа экспрессировались в активной и растворимой форме. При культивированиивсех ферментов наблюдался близкий выход биомассы, однако выходы поактивности отличались друг от друга. Это связано, главным образом, с болеенизким выходом активного растворимого фермента, а также с изменениемудельной активности с D-метионином, который использовали для измеренияактивности ферментов. В случае мутантной TvDAAO M104F наблюдалсянаименьший выход растворимого белка, в то время как самый большой выход имелTvDAAO M104E.
Таким образом, вводимые замены в среднем приводят кснижению уровня экспрессии мутантных TvDAAO.Таблица 4.2.Результаты экспрессии (в клетках E.coli) и очистки мутантных TvDAAO сзаменами в 104 положении и фермента дикого типа.КультивированиеОчисткаФормаTvDAAOВыходВыходактивногобиомафермента,ссы, г/лЕд/л*Выходраств.фермента,мг/лВыход по КонцентУдельная Отношениеактивности рацияактивность, поглощенияпослефермента,Ед/мгA280/A455очистки, % мкг/млДикий тип15,3118008455951408,3M104A14,665007864133839,2M104S15,167005663921209,0M104V15,871004670811559,5M104I14,672006175951198,4M104L14,6710039981261808,6M104F16,350003872861308,5M104Y15,64300497179878,7M104W15,677005862641329,7M104E13,7890088838510110,0M104K12,656007276111788,7Del_99-11015,61200241810,25029,6*Активность ферментов определяли по D-метионину94Рис.
4.5. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO M104A, 2 –TvDAAO M104I, 3 – TvDAAO M104L, 4 – TvDAAO M104S, 5 – TvDAAOM104V, 6 – TvDAAO дикого типа, M – маркер (мол. массы указаны в кДа).Рис. 4.6. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO M104F, 2 –TvDAAO M104Y, 3 – TvDAAO M104W, 4 – TvDAAO дикого типа, M – маркер(мол. массы указаны в кДа).95Очистка всех мутантных TvDAAO и фермента дикого типа была проведена спомощью анионообменной хроматографии на колонке MonoQ и обессоливания наколонкеG25(см.пункт3.2.11).АналитическийSDS-электрофорезвполиакриламидном геле показал, что все препараты ферментов были получены ввысокоочищенном виде и имели чистоту не менее 95% (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
