Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 20

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 20)

Анализданных таблиц 4.7 и 4.8 и рис. 4.12 свидетельствует о том, что температурнаястабильность мутантных TvDAAO с заменами в 104м положении коррелирует собъемом, формой, гидрофобностью, то есть с природой вводимого остатка. Поувеличению температурной стабильности мутантные TvDAAO и фермент дикоготипа располагаются в следующем ряду: TvDAAO M104A, TvDAAO M104S,TvDAAO M104V,TvDAAO M104I,TvDAAO M104W,TvDAAO M104Y,TvDAAO M104L,TvDAAO M104F.TvDAAO дикийНаибольшийтип,эффектстабилизации наблюдается в случае замены M104F. Например, при температуре56°С, для которой приведены кинетические кривые на рис. 4.12, константыскорости первой и второй стадии термоинактивации уменьшились в 3,4 и 4 разасоответственно. Период полуинактивации при этой температуре вырос более чем в11 раз, что является значительным результатом для повышения температурнойстабильности TvDAAO.112Таблица 4.7.Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации мутантных TvDAAO ифермента дикого типа (концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0)*.Температура,°СФормаПараметрTvDAAO485052545658606264Дикий типKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-**-1,273,673,131,349,25,66,011,67,19,321,510,814,64119,4--M104AKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-12,61 4,18*** 4,263,655,87,81,234,401,727,216,46,910,44216,214,85548---M104SKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-11,151,881,531,544,003,285,18,54,246,113,85,412,423,110,513,63029---M104VKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-1,614,471,441,685,53,752,818,46,35,420,410,45,9473022,15945--M104IKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-1,772,401,762,514,052,368,710,74,79,222,28,813,73318,821,05439--M104LKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-1,353,001,221,603,801,491,615,94,012,5711,76,23,1619,214,45,73829--M104FKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1---1,101,531,071,362,171,761,973,402,313,166,44,573,8610,09,220,019,3M104YKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1--1,522,020,951,622,521,643,355,72,564,5910,13,775,118,49,66,43023,2-M104WKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-0,301,331,700,692,372,341,303,673,512,097,04,83,1312,19,98,423,415,7--M104EKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-11,302,601,381,524,122,543,178,94,77,914,39,916,627,015,4----0,192,862,28Kdis·107, M0,610,901,774,3111,14 -1k1·10 , c4,076,97,815,524,1M104K4 -1k2·10 , c2,293,395,38,414,0* – ошибка эксперимента составляла не более 15%** – параметр не определяли из-за очень малого или очень большого значения констант*** – уменьшение параметров термоинактивации мутантных TvDAAO по сравнению с ферментомдикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном, небольшое изменение –серым, увеличение – красным.

Более темный фон соответствует большему эффекту.113Таблица 4.8.Периоды полуинактивации мутантных TvDAAO и фермента дикого типа(концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0)*.Форма TvDAAOτ1/2, мин.; температура,°С485052545658606264Дикий тип-7347237,24,72,7--M104A2414,5**10,35,52,51,5---M104S76339,18,23,61,9---M104V-48298,95,02,91,3--M104I-51237,34,12,21,5--M104L-472615,46,14,22,3--M104F---107823714,08,14,7M104Y--965716,56,34,63,2-M104W-158833212,36,23,2--M104E803814,06,32,5----M104K875117,56,34,1----* – ошибка эксперимента составляла не более 15%** – увеличение периодов полуинактивации (τ1/2) мутантных TvDAAO по сравнению с ферментомдикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном, небольшое изменение –серым, увеличение – красным. Более темный фон соответствует большему эффекту.Для более полной оценки влияния точечных замен на температурнуюстабильностьтемпературныеTvDAAO,длякаждогозависимости константмутантаскоростибылипервойпроанализированыивторойстадийинактивации.

Для этого было использовано уравнение теории активированногокомплекса (ТАК). Согласно теории активированного комплекса константа скоростимономолекулярной реакции зависит от температуры следующим образом:G S  H k Tk TBBRTRk mono eee RThhЭто уравнение приводится к следующему линейному виду: k  S  H kH  1monoBln ln const  h  T RRTR TНа рис. 4.16. приведены зависимости констант скоростей первой и второйстадий инактивации от температуры в координатах ТАК.114wt-TvDAAOTvDAAO M104ATvDAAO M104STvDAAO M104VTvDAAO M104ITvDAAO M104LTvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104W-11ln(k1/T)-12-13-14-15-160,002950,003000,003050,003100,00315-11/T, KАwt-TvDAAOTvDAAO M104ATvDAAO M104STvDAAO M104VTvDAAO M104ITvDAAO M104LTvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104W-11ln(k2/T)-12-13-14-15-160,002950,003000,003050,003100,00315-11/T, KБРис. 4.16.

Температурные зависимости констант скорости первой (k1/T от 1/T, А) и второй(k2/T от 1/T, Б) стадий термоинактивации в полулогарифмических координатахдля мутантных TvDAAO с заменами M104A (♦,─), M104S (▲,─), M104V ( ,─),M104I (►,─), M104L (▼,─), M104F (▲,─), M104Y (●,─), M104W (♦,─) иTvDAAO дикого типа (■,─). Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН8,0.115На первой стадии процесса термоинактивации все мутантные TvDAAO,кроме TvDAAO M104I, и фермент дикого типа имеют одинаковый характеризменения констант скорости инактивации от температуры.

Для замен M104A,M104S, M104V константы первой стадии k1 лежат выше таковых для дикого типаво всем температурном диапазоне, т.е. эти ферменты менее стабильны. Для заменыM104I константа k1 растет с температурой быстрее, чем для фермента дикого типа,что выражается в более низкой стабильности TvDAAO M104I на первой стадиипри температурах выше 56°С, тогда как при более низких температурах данныймутант сравним с ферментом дикого типа. Для TvDAAO M104L значения константk1 в пределах ошибки совпадают с таковыми для фермента дикого типа.

Длямутантных TvDAAO M104F, M104Y, M104W значения k1 лежат ниже, чем дляTvDAAO дикого типа во всем температурном диапазоне (рис. 4.16А).Несколько другая картина наблюдается для температурных зависимостейконстант скорости второй стадии термоинактивации. В случае мутантных TvDAAOс заменами M104A, M104S, M104V, M104I и M104L константы скорости второйстадии с температурой растут быстрее, чем для фермента дикого типа.

Так навторой стадии термоинактивации по своей стабильности с ферментом дикого типасравнимымутантныеTvDAAO M104Aпритемпературениже50°С,TvDAAO M104V – при 50°С и ниже, TvDAAO M104I – 54°С и ниже,TvDAAO M104L – при 56°С и ниже. TvDAAO M104S по второй стадии менеестабильный, чем фермент дикого типа во всем изученном диапазоне.

МутантныеTvDAAO с ароматическими заменами M104F, M104Y и M104W по второй стадиистабильнее дикого типа во всем температурном диапазоне. Для TvDAAO M104Wвид зависимости k2 от температуры близок к таковому для фермента дикого типа, адля TvDAAO M104F и M104Y константа второй стадии быстрее растет стемпературой, что говорит о большем эффекте стабилизации при более низкихтемпературах (рис. 4.16Б). Несмотря на то, что остаток Met104 располагает близкок поверхности фермента на входе в активный центр, он находится в гидрофобномокружении. Подобные температурные зависимости констант скорости второйстадии инактивации и небольшие эффекты стабилизации при более низких116температурах для замен M104A, M104V, M104I и M104L можно объяснитьвозможным усилением гидрофобных взаимодействий, поскольку в случае заменыM104S подобного эффекта не наблюдается.

Кроме того, замена остатка Met104может предотвращать его окисление при повышенных температурах. С такимипредположением согласуется суммарная стабильность TvDAAO M104L, котораяблизка к стабильности фермента дикого типа (рис. 4.12, 4.16 и табл. 4.7, 4.8). Сдругой стороны, введение небольших аминокислотных замен может открыватьбольший доступ растворителю в активный центр фермента. В результате, введениетаких замен суммарно не приводит к стабилизации TvDAAO, а наоборотдестабилизируютферментвовсемизученномтемпературномдиапазоне.Наибольший стабилизационный эффект наблюдается в результате введенияароматических аминокислотных остатков, особенно в случае замены M104F, что,вероятно, объясняется усилением взаимодействий с соседними остатками Phe54 иPhe258. По-видимому, введение аминокислотных замен различной природы в 104еположение по-разному влияет на температурную стабильность TvDAAO в силукомплекса описанных выше причин.Дляпервойивторойстадийтермоинактивациибылинайденыактивационные параметры – энтальпия и энтропия активации, а такжеАррениусовскаяэнергияактивации.Изтангенсаугланаклонапрямых,представленных на рис.

4.16, было рассчитано значение энтальпии активации H#.Величины Ea были получены из аналогичных зависимостей в координатах ln(k) от1/T. Для минимизации ошибки определения, величина энтропии активации S#была найдена из значения тангенса угла наклона зависимости свободной энергииактивации G# от температуры:G   H   ТS Для расчета G# было использовано выражение, следующее из основногоуравнения теории активированного комплекса: kG   RT  ln  B  hk  ln  2Tk T   RT ln  B k2h117Графики зависимости G# от Т для TvDAAO M104F для первой и второйстадии термоинактивации представлены на рис.

4.17.115000y = - 396x + 234100R2 = 0,9547110000105000100000G2 , Дж/мольG1 , Дж/моль11500010500010000095000950009000090000324327330333336y = - 473x + 260530R2 = 0,9873110000339324327330T, K333336339T, KАБ≠Рис 4.17. Зависимости свободной энергии активации ΔG от температуры для первой (А)и второй (Б) стадии термоинактивации для мутантной TvDAAO M104F.Результаты приведены в таблице 4.9. Активационные параметры H# и Ea напервой стадии термоинактивации для всех мутантных TvDAAO близки междусобой в пределах ошибки эксперимента.

Характеристики

Список файлов диссертации