Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 22
Текст из файла (страница 22)
4.9).4.1.6. Удаление соединительной петли с 99 по 110 остатокв структуре TvDAAOПолученные результаты в ходе направленного мутагенеза остатка Met104,который входит в описанную выше соединительную петлю с 95 по 120 остатки,говорят о том, что данный структурный элемент может играть весьма важную рольв поддержании стабильной структуры TvDAAO. Чтобы проверить данноепредположение,намибылорешеноудалитьдополнительныйучастоксоединительной петли с 99 по 110 остатки, который отсутствует у более чем 90%последовательностей DAAO (рис. 2.2). Как былоописановыше, данноеструктурное отличие хорошо видно при наложении трехмерных структур TvDAAOи RgDAAO (рис.
4.2) Нами было проведено компьютерное моделированиеструктуры TvDAAO Del_99-110 на основе структуры TvDAAO дикого типа ивыполнено наложение этих двух структур (рис. 4.25), на котором структураTvDAAO дикого типа показана зеленым цветом, синим цветом выделен удаляемый128участок соединительной петли в районе активного центра, бордовым цветомпоказана модельная структура TvDAAO Del_99-11.Рис. 4.25.
Наложение модельной структуры TvDAAO Del_99-110 (выделена бордовымцветом) на структуру TvDAAO дикого типа (выделена зеленым цветом).Удаленный участок петли в области активного центра TvDAAO дикого типавыделен синим цветом.В области активного центра структура TvDAAO Del_99-110 очень похожа наструктуру RgDAAO (рис. 4.2). На рис. 4.26 представлены активные центрыTvDAAO дикого типа и модельной TvDAAO Del_99-110, цветом показанаповерхность доступная растворителю. При сравнении хорошо видно, что удалениечасти соединительной петли, с одной стороны, приводит к значительномуувеличению доступа растворителя в активный центр фермента, а с другой стороныприводиткисчезновениювзаимодействийсблизкорасположеннымиаминокислотными остатками. В результате такой делеции можно ожидать129значительного изменения каталитических свойств и температурной стабильностиTvDAAO.АБРис. 4.26.
Активный центр TvDAAO дикого типа (А) и модельной TvDAAO Del_99-110(Б). Цветом показана поверхность доступная растворителю.Получениепункту 4.1.2.TvDAAO Del_99-110Олигонуклеотидныепроводилипраймерыдляполностьюаналогичнонаправленногоудаленияпоследовательности из гена tvdaao представлены в таблице 4.10. Секвенированиеплазмид подтвердило удаление соответствующей последовательности нуклеотидовиз гена tvdaao. В процессе культивирования мутантная TvDAAO Del_99-110экспрессировалась в активной и растворимой форме. Результаты культивированияпредставлены в таблице 4.2. Количество биомассы, полученное в результатекультивирования TvDAAO Del_99-110 и TvDAAO дикого типа практическиодинаково,новыходактивногоирастворимогоферментавслучаеTvDAAO Del_99-110 значительно ниже, чем для фермента дикого типа. Это можетбыть связано как с более низкой удельной активностью фермента с D-метионином,так и с более низкой стабильностью и уровнем экспрессии фермента в клеткахE.coli.
Результаты очистки и параметры образцов для изучения свойствпредставлены в таблице 4.2.130Таблица 4.10.Олигонуклеотидные праймеры для введения делеции в ген tvdaao.МутацияИсходнаяпослед-тьDel_99110*Нуклеотидная последовательность*For5’– C AAG CGT GAT CTT CCT AAA CTG GAA GGT GCC ATGTCG GCC ATC TGT CAA CGC AAC CCC TGG TTC AAA AAC ACAGTC –3’Rev5’- GTT TTT GAA CCA GGG GTT GCG TTG ACA GAT GGC CGACAT GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG ATC ACG CTT GAG AACATG -3’Mfor5’- C AAG CGT GAT CTT CCT AAC CCC TGG TTC AAA AACACA GTC -3’Mrev5’- GTT TTT GAA CCA GGG GTT AGG AAG ATC ACG CTT GAGAAC ATG -3’Подчеркиванием показана удаляемая последовательность в гене tvdaao,соответствующая аминокислотной последовательности TvDAAO c 99 по 110 остаток.Полужирным шрифтом выделены нуклеотидные замены между которыми вводитсяделеция.Аналитический SDS-электрофорез в полиакриламидном геле показал, чтовсе препараты ферментов были получены в высокоочищенном виде и имеличистоту не менее 95% (рис.
4.19). Кроме того, электрофорез нерастворимых ирастворимых фракций (клеточные стенки после разрушения клеток и бесклеточныеэкстракты соответственно) показал, что TvDAAO Del_99-110 и фермент дикоготипа присутствуют как в растворимой, так и нерастворимой формах (рис. 4.19,дорожки 5-8). Однако в отличии от фермента дикого типа, содержание дляTvDAAO Del_99-110 в растворимой фракции значительно ниже, чем в осадкеклеточных стенок.
Поскольку ферментативная активность TvDAAO Del_99-110отсутствовала в клеточном дебрисе после разрушения клеток, то весь активныйфермент TvDAAO Del_99-110 находился только в растворе.Спектр поглощения TvDAAO Del_99-110 соответствует спектру поглощенияFAD-содержащих белков с максимумами поглощения на 280, 370 и 450 нм исоотносится со спектром TvDAAO дикого типа (рис. 4.27). Стоит отметить, чтосоотношение поглощения A280/A455 для TvDAAO Del_99-110 аномально высокое.Это говорит о том, что содержание FAD в активном центре этого ферментасущественно ниже по сравнению с ферментом дикого типа. Однако добавлениеразных количеств экзогенного FAD к образцам TvDAAO Del_99-110 не привело кповышению ферментативной активности (табл.
4.11).131Таблица 4.11.Активность TvDAAO Del_99-110 при добавлении экзогенного FAD.С(FAD)/Активность, Ед/млС(TvDAAO Del_99-100)10,38 ± 0,0220,33 ± 0,0240,35 ± 0,02600,34 ± 0,022000,34 ± 0,02Исходя из этого, можно сделать вывод, что большая часть растворимойфракцииTvDAAO Del_99-110находитсявнекоторомденатурированномсостоянии и неспособна связать дополнительные количества FAD.10wt-TvDAAOTvDAAO Del_99-110Поглощение86420250300350400450500550600Длина волны, нмРис.
4.27. Спектры поглощения TvDAAO Del_99-110 (─) и фермента дикого типа (─) приконцентрации 1 мг/мл в диапазоне 250-600 нм.Эксперименты по изучению процесса термоинактивации показали, чтотемпературнаястабильностьTvDAAO Del_99-110сильнопонизиласьпосравнению с ферментом дикого типа. На рис. 4.28 приведены зависимостиостаточной активности в полулогарифмических координатах при 4 и 50°С. Так при4°С TvDAAO Del_99-110 теряля около половины своей активности в течениенедели.
Константа скорости инактивации TvDAAO Del_99-110 почти в 3 разавыше, чем для фермента дикого типа, что может указывать на более слабоесвязывание FAD белковой глобулой TvDAAO Del_99-110 (табл. 4.12), поскольку132при низких температурах потеря активности TvDAAO, главным образом, связана сдиссоциацией кофактора FAD из активного центра фермента.T = 4 oCwt-TvDAAOTvDAAO Del_99-1100,0ln(A/Ao)-0,2-0,4-0,6-0,802468Время, суткиАT = 50 oC, [E]0 = 10 мкг/мл0ln(A/Ao)-1-2wt-TvDAAOTvDAAO Del_99-110-3020406080100120140160Время, минБРис.
4.28. Зависимости остаточной активности от времени для TvDAAO Del_99-110 (▲,─)и TvDAAO дикого типа (■,─) при температуре 4°С (А) и 50°С (Б) вполулогарифмических координатах. Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 МКФБ, рН 8,0.133При повышенных температурах различие в стабильности TvDAAO Del_99-110и фермента дикого типа более значительное.
Так, мутантная TvDAAO Del_99-110при концентрации фермента 10 мкг/мл и температуре 50°С полностью теряетактивность менее, чем за 5 минут, в то время, как фермент дикого типа с такой жеконцентрацией сохраняет около 35% активности при инкубации в течение 150минут при 50°С (рис. 4.28).Таблица 4.12.Константы скорости инактивации TvDAAO Del_99-110 и фермента дикого типапри 4 и 50°С. Значения констант умножены на 106.kinэф×106, с-1Форма TvDAAOДикий типDel_99-110*4°С0,40 ± 0,031,10 ± 0,0750°С110 ± 10*11000 ± 1400Для дикого типа при 50С приведена эффективная k2 (k1=315×10-6, c-1)ЭффективноезначениеконстантыскороститермоинактивациидляTvDAAO Del_99-110 в 100 раз выше, чем соответствующее значение для второйстадии термоинактивации TvDAAO дикого типа (табл.
4.12).Рис. 4.29. Относительные значения констант Михаэлиса (КМ), каталитических констант(kcat) и каталитической эффективности (kcat/КМ) для TvDAAO Del_99-100. За100% приняты значения соответствующих параметров для фермента дикоготипа с каждой D-аминокислотой.134Несмотря на низкую температурную стабильность TvDAAO Del_99-110, намудалось изучить каталитические свойства для этого фермента с рядомD-аминокислотами. Полученные каталитические параметры kcat, КМ и kcat/KМ снабором D-аминокислот приведены в таблице 4.5. Для наглядности на рис.4.29приведена диаграмма с относительными значениями kcat, КМ и kcat/KМ.
ДляTvDAAO Del_99-110наблюдаетсяувеличениезначенийКМсомногимисубстратами, кроме D-Leu (КМ уменьшилось в 5,5 раз) и D-Tyr (КМ не изменилось),уменьшение каталитической активности со многими субстратами, кроме D-Phe (kcatувеличилась в 1,7 раза), что в конечном счете выражается в соответствующемпадении каталитической эффективности (табл. 4.5 и рис.4.29).Таким образом, в данной части работы нами была изучена роль остаткаMet104, который располагается на входе в активный центр. Также, была изученароль соединительной петли в районе активного центра TvDAAO, котораясоединяет два β-листа, образованные 85-94 и 121-125 остатками в структурефермента и включает в себя Met104. Удаление дополнительного участкасоединительной петли, который отсутствует у большинства последовательностейDAAO, показало, что данный структурный элемент играет важную роль как вкаталитических свойствах, так и в поддержании стабильной четвертичнойструктуры TvDAAO.
Полученные данные по направленному мутагенезу остаткаMet104 говорят о том, что данный остаток играет исключительно важную роль вкаталитической активности и температурной стабильности TvDAAO. Введение 10различных замен в данное положение привело к получению мутантных TvDAAO сразличнымипрофилямисубстратнойспецифичности.Крометого,былооднозначно показано, что температурная стабильность мутантных ферментовкоррелирует с природой (размером, формой, гидрофобностью) вводимогоаминокислотного остатка в 104 положение.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
