Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 25
Текст из файла (страница 25)
4.33. Относительные значения констант Михаэлиса (КМ) для мутантных TvDAAO c точечными заменами F54S, F258S, M104S,M104F, M104Y, M104W и двойными заменами F54S/M104S, F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W, M104F/F258S,M104Y/F258S, M104W/F258S. За 100% приняты значения КМ фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.149Рис. 4.34. Относительные значения каталитических констант (kcat) для мутантных TvDAAO c точечными заменами F54S, F258S, M104S,M104F, M104Y, M104W и двойными заменами F54S/M104S, F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W, M104F/F258S,M104Y/F258S, M104W/F258S.
За 100% приняты значения kcat фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.150Рис. 4.35. Относительные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO c точечными заменами F54S,F258S, M104S, M104F, M104Y, M104W и двойными заменами F54S/M104S, F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W,M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S.
За 100% принята каталитическая эффективность фермента дикого типа с каждойD-аминокислотой.151Рис. 4.36. Абсолютные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO c точечными заменами F54S,F258S, M104S, M104F, M104Y, M104W и двойными заменами F54S/M104S, F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W,M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S.1524.2.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с двойнымизаменамиИзучение температурной стабильности мутантных TvDAAO с двойнымизаменами F54S/M104S, F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W, M104F/F258S,M104Y/F258S, M104W/F258S проводили по кинетике инактивации. Экспериментыпри различных температурах и начальных концентрациях ферментов показали, чтотермоинактивация всех двойных мутантов протекает по диссоциативномумеханизму, что подтверждалось наличием точек излома на зависимостяхостаточной активности от времени в полулогарифмических координатах иувеличением тангенса угла наклона второго линейного при уменьшении начальнойконцентрации фермента.
(см. главу 4.1). Исходя из этого, для корректнойинтерпретации экспериментальных данных, зависимости остаточной активности отвремени при различных температурах для всех двойных и точечных мутантов былиполучены при одинаковой начальной концентрации ферментов равной 10 мкг/мл.Подобные зависимости при 56°C приведены на рис. 4.37 для TvDAAO F54S/M104F,F54S/M104Y,F54S/M104Wинарис. 4.38дляTvDAAO M104F/F258S,M104Y/F258S, M104W/F258S в сравнении с точечными предшественникамиTvDAAO F54S, M104F, M104Y, M104W, F258S и ферментом дикого типа. Привведении точечной замены F54S в дополнение к заменам в 104м положении эффектдестабилизации увеличивается в ряду F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W,причем двойной мутант TvDAAO F54S/M104W по скорости инактивации сравним сTvDAAO F54S (рис. 4.37).
Другими словами, в случае мутанта TvDAAO F54S(рис. 4.30В)дополнительныезаменыостаткаMet104наароматическиеаминокислоты стабилизируют такой фермент в разной степени, причем этот эффектрастет в зависимости от вводимого остатка в ряду Trp – Tyr – Phe. Аналогичнаяситуация наблюдалась в случае фермента дикого типа, т.е.
когда в 54 положениинаходится остаток Phe (рис. 4.12 и 4.30). Совершенно другая ситуация наблюдаетсяв случае TvDAAO M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S. Введение заменыF258S в дополнение к M104F, M104Y и M104W приводит к снижениютемпературной стабильности ферментов практически в раной степени (рис. 4.38).153T = 56 oC, [E]0= 10 мкг/млwt-TvDAAOTvDAAO F54STvDAAO M104FTvDAAOM104YTvDAAO M104WTvDAAO F54S/M104FTvDAAO F54S/M104YTvDAAO F54S/M104WОстаточная активность, A/Ao1,00,80,60,40,20,0020406080100120140Время, минРис.
4.37. Зависимости остаточной активности от времени для мутантных TvDAAO сзаменами F54S ( ,─), M104F (▲,─), M104Y (●,─), M104W (♦,─), F54S/M104F( ,─ ─), F54S/M104Y ( ,─ ─), F54S/M104W ( ,─ ─) и TvDAAO дикого типа(■,─). Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 56 °С.T = 56 oC, [E]0= 10 мкг/млwt-TvDAAOTvDAAO F258STvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104WTvDAAO M104F/F258STvDAAO M104Y/F258STvDAAO M104W/F258SОстаточная активность, A/Ao1,00,80,60,40,20,00102030405060Время, минРис. 4.38. Зависимости остаточной активности от времени для мутантных TvDAAO сзаменами F258S ( ,─), M104F (▲,─), M104Y (●,─), M104W (♦,─), M104F/F258S( ,), M104Y/F258S ( ,), M104W/F258S ( ,) и TvDAAO дикоготипа (■,─). Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, 56 °С.154Таким образом, в случае TvDAAO F258S введение ароматических замен в104е положение практически не стабилизирует такой фермент, в отличие отTvDAAO дикого типа и TvDAAO F54S.
По-видимому, остаток Phe258 играет болееважную роль в температурной стабильности TvDAAO и является более значимымдля взаимодействия с ароматическими заменами в 104м положении.Для более подробного анализа температурной стабильности мутантныхTvDAAO и фермента дикого типа, нами были рассчитаны истинные константыскорости для первой и второй стадии процесса термоинактивации в соответствии стеориейдиссоциативнойинактивации(табл.
4.18),атакжепериодыполуинактивации для всех ферментов при всех изученных температурах(табл. 4.19). Из данных таблиц 4.18 и 4.19 видно, что для двойных мутантовTvDAAO F54S/M104Y и TvDAAO F54S/M104W температурные диапазоны, вкоторых реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, сместились на2°С в область низких температур по сравнению с точечными мутантамиTvDAAO M104Y и TvDAAO M104W, соответственно.
Мутантные TvDAAO M104FиTvDAAO M104F/F258Sимеютодинаковыйтемпературныйдиапазонтермоинактивации от 54 до 64°С. Все мутантные TvDAAO с двойными заменами в104/258 положениях, как и TvDAAO F258S, были изучены в диапазоне от 46 до56°С.Для оценки аддитивности мутаций мы использовали подход, аналогичныйпредложенномувработе[187].Посколькуповышениетемпературнойстабильности связано с понижением констант скорости инактивации, то дляпростоты и большей наглядности в качестве параметров αэксп и αтеор для точечных имноготочечных мутантов мы использование значения эффектов стабилизации,которые рассчитываются как:αэксп = kinwt/kinmut*, где kinwt – константа скорости инактивации фермента дикоготипа, kinmut – константа скорости инактивации точечных и многоточечных мутантов.nαтеор = kin /kinwtmut, где n – число объединенных замен.i 1155Таблица 4.18.Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации мутантных TvDAAO с заменами в54, 104, 258, 54/104 и 104/258 положениях (концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН8,0)*.ФормаTvDAAOПараметр464850752Температура,°С545658606264Kdis·10 , M-**0,191,271,346,09,314,6k1·104, c-12,863,679,211,621,5414 -1k2·10 , c2,283,135,67,110,819,4Kdis·107, M0,601,803,8319,5k1·104, c-11,856,712,227,8F54Sk2·104, c-13,814,547,711,47Kdis·10 , M1,10*** 1,361,973,16 3,86k1·104, c-11,532,173,406,410,0 20,0M104Fk2·104, c-11,071,762,314,579,2 19,3Kdis·107, M1,521,623,354,595,16,44 -1k1·10 , c2,022,525,710,118,430M104Yk2·104, c-10,951,642,563,779,623,27Kdis·10 , M0,300,691,302,093,138,44 -1k·10,c1,332,373,677,012,123,4M104W1k2·104, c-11,702,343,514,89,915,7Kdis·107, M1,151,545,16,112,413,6k1·104, c-11,884,008,513,823,130M104Sk2·104, c-11,533,284,245,410,5297Kdis·10 , M0,500,703,405,96,14 -1k·10,c3,777,38,411,418,7F258S1k2·104, c-13,234,758,012,014,37Kdis·10 , M0,560,873,043,71 4,41 6,71,633,656,310,1 22,139F54S/M104F k1·104, c-1k2·104, c-11,982,803,636,716,6357Kdis·10 , M1,132,754,07,016,9304 -11,922,785,511,916,534F54S/M104Y k1·10 , ck2·104, c-11,521,742,475,49,915,7Kdis·107, M0,491,443,969,813,8371,934,184,558,714,530F54S/M104W k1·104, c-14 -1k2·10 , c1,592,072,743,608,816,9Kdis·107, M 1,38 2,464,2910,522,14 -12,58 3,835,77,715,1F54S/M104S k1·10 , ck2·104, c-11,69 2,183,415,910,77Kdis·10 , M 0,42 0,801,792,705,58,45,19,821,940M104F/F258S k1·104, c-1 2,07 3,604 -1k2·10 , c1,67 2,542,935,28,716,7Kdis·107, M 1,17 2,333,054,406,79,54 -15,05,89,119,42536M104Y/F258S k1·10 , ck2·104, c-11,62 1,942,505,111,517,9Kdis·107, M 0,50 0,832,133,447,616,14 -1k·10,c3,024,307,114,127,143M104W/F258S 14 -1k2·10 , c2,33 3,303,726,812,221,7*Ошибка эксперимента составляла не более 15%, **параметр не определяли из-за очень малого илиочень большого значения констант, ***уменьшение параметров термоинактивации мутантныхTvDAAO по сравнению с ферментом дикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном,небольшое изменение – серым, увеличение – красным.
Более темный фон соответствует большемуэффекту.Дикий тип156Соответственнопараметрыαэкспестьэкспериментальныеэффектыстабилизации для каждого мутантного фермента относительно фермента дикоготипа. Значения αтеор могут быть рассчитаны только для многоточечных мутантовкак произведение эффектов стабилизации отдельных точечных замен. Еслизначение αэксп>1, то наблюдается повышение температурной стабильности, еслиαэксп<1 – стабильность снижается. Поскольку TvDAAO инактивируется всоответствии с двухстадийным диссоциативным механизмом, то указанныепараметры рассчитываются для каждой стадии процесса термоинактивации.Эффект аддитивности может быть рассчитан как отношение этих двух параметров(αэксп/αтеор) выраженное в %.Таблица 4.19.Периоды полуинактивации мутантных TvDAAO и фермента дикого типа(концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0)*.τ1/2, мин.; температура, °СФормаTvDAAO46485052545658606264Дикий тип--7347237,24,72,7--F54S---40**145,01,1---M104F----107***823714,08,14,7M104Y---965716,56,34,63,2-M104W--158833212,36,23,2--M104S-76339,18,23,61,9---F258S-64359,84,13,0----F54S/M104F----12358179,04,32,2F54S/M104Y-132472811,15,22,9--157441710,65,32,2---F54S/M104WF54S/M104S65251610,65,0-----M104F/F258S160662910,64,72,5----M104Y/F258S6213,49,25,03,72,6----M104W/F258S1044613,77,63,42,3----* – ошибка эксперимента составляла не более 15%оцененные из данных по** – италиком отмечены периоды полуинактивации (τ1/2)термоинактивации при концентрации фермента не равной 10 мкг/мл***– увеличение периодов полуинактивации мутантных TvDAAO по сравнению с ферментомдикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном, небольшое изменение –серым, увеличение – красным.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
