Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 27
Текст из файла (страница 27)
4.40. Температурные зависимости констант скорости первой (k1/T от 1/T, А) и второй(k2/T от 1/T, Б) стадии термоинактивации для мутантных TvDAAO с заменамиF258S ( ,─), M104F (▲,─), M104Y (●,─), M104W (♦,─), M104F/F258S ( ,), M104Y/F258S ( ,), M104W/F258S ( ,) и TvDAAO дикого типа(■,─). Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0.163Таблица 4.21.Активационные параметры первой и второй стадий инактивации мутантных TvDAAOи фермента дикого типа (0,1 М КФБ, рН 8,0).1я стадия инактивации2я стадия инактивации#S ,S#,ФормаEa,Ea,H#,H#,Дж/(моль*Дж/(моль*кДж/молькДж/молькДж/молькДж/мольTvDAAOК)К)Дикий тип237±18420±40240±17185±11260±30187±10F54S388±40880±130391±40168±20200±60170±20M104F233±12400±40236±13260±20470±60263±20M104Y256±15470±40259±15277±30530±80280±30M104W251±8460±20254±10198±15300±40201±15M104S244±20440±60247±20230±30400±90232±30F258S157±20180±60160±20169±14214±45172±14F54S/M104F281±10540±30284±10264±30490±90267±30F54S/M104Y260±13490±50262±13223±20370±70225±20F54S/M104W225±19390±60228±19204±30320±60207±30F54S/M104S181±15250±50183±15201±18310±60203±18M104F/F258S258±16490±50260±16194±18290±60197±18M104Y/F258S185±16270±50187±16223±30380±80225±30M104W/F258S224±9390±30227±9189±17280±60192±17Таким образом, с помощью направленного мутагенеза, нами были изученывзаимодействиямеждуостаткамиPhe54,Phe258иароматическимиаминокислотными заменами в 104м положении, за счет парного объединения заменM104F, M104Y, M104W, M104S с заменами F54S и F258S.
Все изученные остаткирасполагаются на входе в активный центр фермента. Результаты экспериментовпоказали, что введенные замены приводят к заметному изменению профилясубстратнойспецифичностиTvDAAO.Приобъединенииточечныхаминокислотных замен в двойные, профили субстратной специфичности двойныхмутантов с большинством D-аминокислот, главным образом, определяютсязаменами F54S и F258S. Однако каталитическая активность с большинствомD-аминокислот обусловлена влиянием каждой пары точечных мутаций.
Данные поизучению температурной стабильности точечных и двойных мутантов TvDAAO164показали, что взаимодействие между остатками в 104м положении и остаткомPhe258 вносят наибольший вклад в стабилизацию TvDAAO в случае заменыM104Y и, особенно, в случае M104F. Стабилизационный эффект при введениизамены M104W, по-видимому, в равной степени обусловлен взаимодействиями 54104 и 104-258. В пользу взаимодействий не гидрофобной природы междуароматическими остатками, говорит тот факт, что замена M104L практически неизменила, а замена M104I ухудшила температурную стабильность TvDAAO,причем остатки Leu и Ile по объему близки к остатку Met, но при этом обладаютбольшей гидрофобностью [170]. По этой же приине повышение стабильности засчет введение ароматических замен нельзя объяснить предотвращением окисленияостатка Met104.
То есть, если бы стабилизационный эффект объяснялся толькогидрофобными взаимодействиями и отсутствием химической модификацииMet104, то в этом случае стоило ожидать повышенную термостабильностьмутантных TvDAAO M104I и TvDAAO M104L. Кроме того, экранированиеактивного центра от растворителя также целиком не объясняет данный феномен,посколькутогдастоилоожидатьнаибольшуюстабильностьмутантаTvDAAO M104W или, по крайней мере, близкие стабильности мутантов привведении трех ароматических замен M104F, M104Y и M104W. По-видимому,причина такого значительного эффекта стабилизации TvDAAO заключается вароматической природе вводимых остатков.
Наибольшее увеличение стабильностинаблюдается в случае введения остатка Phe. Вероятно, данный остаток наилучшимобразом подходит по объему и конфигурации для оптимального взаимодействия сблизкорасположеннымиостаткамиPhe54иPhe258.Крометого,экспериментальные данные также указывают на наличие взаимодействия междуPhe54 и Phe258. Все вышеизложенное позволяет, с определенной долейуверенности, сделать вывод о том, что повышение температурной стабильностиобусловлено взаимодействиями между остатками Phe54, Phe(Tyr, Trp)104 и Phe258,которыеявляютсяароматическимиπ-π взаимодействиями,имеющимиэлектростатическую природу. На такую возможность также указывают результатыкомпьютерного моделирования (рис.
4.30).1654.3. Оптимизация структуры FAD-связывающего домена TvDAAOРациональный белковый дизайн является мощным методом изученияструктурно-функциональных взаимосвязей и направленного изменения свойствбиотехнологически важных ферментов. Одним из важных направлений такойработы является повышение температурной стабильности, в ходе которойрешаются не только важные прикладные задачи, но и накапливаются ценныеэкспериментальные данные о взаимосвязи структуры и стабильности фермента, чтопредставляет большой фундаментальный интерес.
Для ферментов с повышеннойстабильностью упрощается процесс выделения и очистки, а также увеличиваютсявыходы целевого высокоочищенного препарата фермента, что, в свою очередь,приводит к снижению стоимости конечного биокатализатора.В рамках рационального белкового дизайна для направленного увеличениятемпературной стабильности ферментов, как правило, используют сравнениеаминокислотных последовательностей исследуемого фермента и ферментов изтермофильных организмов, а также анализ трехмерной структуры (если онадоступна хотя бы для одного фермента из семейства) с целью выявленияаминокислотных остатков, играющих важную роль в стабильности [188–190].
Вслучае TvDAAO такой подход не может быть использован, поскольку данныйфермент является наиболее стабильным среди изученных на данный моментоксидаз D-аминокислот, а аминокислотные последовательности DAAO изтермофильных микроорганизмов до сих пор не известны. Кроме того, как былоотмечено в обзоре литературы, к настоящему времени опубликовано всегонесколько статей по увеличению температурной стабильности TvDAAO cпомощью белковой инженерии, однако во всех случаях эффекты стабилизациибыли незначительными [57,148,161]. В данной части работы нами был использованкомплексный подход для повышения температурной стабильности TvDAAO.Важной особенностью всех DAAO является наличие вблизи N-концаконсервативной последовательности GXGXXG (рис. 2.2), которая указывает наналичие в молекуле белка структурного элемента, известного как “укладка поРоссману”(Rossmanfold),представляющего166собойопределеннуюпространственную комбинацию α-спиралей и β-листов [27,29].
Этот структурныйдоменотвечаетзасвязываниеадениновойчастиNADиFADвкофермент-связывающих доменах многих оксидоредуктаз. В случае TvDAAO,каждая субъединица активного фермента содержит одну молекулу нековалентносвязанного FAD в активном центре. Из литературы известно, что при повышенныхтемпературах (выше 40-50оС) потеря активности TvDAAO в основном обусловленаденатурацией белковой глобулы и диссоциацией кофактора FAD из активногоцентра фермента [35]. Исходя из этого, нами было выдвинуто предположение, чтовведение аминокислотных замен, которые способны усилить связывание FAD вкофермент-связывающем домене, может привести к повышению температурнойстабильности TvDAAO. Для поиска таких положений нами был проведенподробный компьютерный анализ трехмерной структуры TvDAAO, анализмножественного аминокислотного выравнивания последовательностей DAAO изразличныхисточников(рис.
2.2)иэкспериментыпокомпьютерномумоделированию аминокислотных замен в кофермент-связывающем доменеTvDAAO.4.3.1. Анализ структуры FAD-связывающего домена TvDAAO. Компьютерноемоделирование.Проведенный анализ структуры TvDAAO показал, что с молекулой FAD вактивном центре TvDAAO взаимодействуют по крайней мере 15 аминокислотныхостатков: Ala9, Ala12, Ser31, Glu32, Phe33, Thr43, Ser44, Asn50, Val171, Arg302,Ala329, Gly330, Gly332, Tyr333 и Gln334. Схематично указанные остатки и ихвзаимодействия с FAD показаны на рис.
4.41. Первая группа остатков вблизиN-конца (Ala9, Ala12, Ser31, Glu32, Phe33, Thr43, Ser44, и Val171) формируеткофермент-связывающий домен в нижней части субъединицы TvDAAO и образуетводородные связи с рибозой, фосфатными группами и адениновой частьюмолекулы FAD. Остальные остатки (Asn50, Arg302, Ala329, Gly330, Gly332, Tyr333и Gln334) располагаются в области каталитического центра TvDAAO ивзаимодействуют с изоаллоксазиновым циклом молекулы FAD посредством167гидрофобных взаимодействий и водородных связей. Кроме того, компьютерныйанализпоказал,чтомеждуизоаллоксазинанаблюдаетсяупоминалосьглаве 4.2.востаткомкатионноеМутагенезArg302иароматическимπ+-π взаимодействие,аминокислотныхоостатковядромкоторомвсамомкаталитическом центре TvDAAO, которые также участвуют в связываниисубстратов (Arg302, Ala329, Gly330, Gln334), является нецелесообразным,поскольку их замена на другие аминокислотные остатки может привести кнарушению правильной ориентации изоаллоксазинового цикла FAD, которыйнепосредственно является акцептором электронов и играет ключевую роль вкатализе.
В результате может произойти частичная или полная потерякаталитической активности TvDAAO. Кроме того, большая часть данных остатковнаходится в высоконсервативной области и является консервативными илиполуконсервативными (рис. 2.2), что также указывает на их важную структурнофункциональную роль.Рис. 4.41. Схематичное строение FAD-связывающего домена TvDAAO.
Зеленымпунктиром показаны водородные связи между молекулой FAD иокружающими аминокислотными остатками, оранжевой линией показанокатионное π -взаимодействие между остатком R302 и изоаллоксазинвымциклом FAD, голубым очертанием выделены аминокислотные остатки и атомыдоступные растворителю.Таким образом, поиск перспективных положений для мутагенеза сузился довосьми аминокислотных остатков Ala9, Ala12, Ser31, Glu32, Phe33, Thr43, Ser44, иVal171, которые располагаются в кофермент-связывающем домене TvDAAO и168взаимодействуют с фосфатными группами, рибозой и адениновой частьюмолекулы FAD (рис. 4.41).
При дальнейшем анализе первичной и четвертичнойструктуры нами было уделено особое внимание DAAO из дрожжей Rhodotorulagracilis (Rhodosporidium toruloides), поскольку из литературы известно, что данныйфермент обладает самым высоким связыванием FAD из всех изученных на данныймомент DAAO (Kdis=2*10-8 М) [2,6,36]. Для определения положений длянаправленного мутагенеза нами был проведен подробный анализ расположения ивзаимодействия с молекулой FAD всех вышеперечисленные остатков.Остатки Ala9 и Ala12 являются частью консервативной последовательностиGXGXXG, которая располагается около рибозы и фосфатных групп FAD на изгибемежду β-листом 1-8 и α-спиралью 12-23, однако сами по себе эти остатки неявляются консервативными. У других DAAO в положении, соответствующем Ala9в последовательности TvDAAO, встречаются остатки Gly, Ser и Cys.
На местеостатка Ala12 часто встречаются остатки Ser, Ile, Val, а также остатки Met, Asn, Glnи Ala. У RgDAAO в этих двух положениях находятся остатки Ser и Ileсоответственно. Остаток Ala9 расположен около 3’-окси-группы рибозы и образуетводородную связь атомами основной цепи с боковой группой остатка Ser31.Остаток Ala12 образует водородные связи атомами основной цепи с остаткомфосфорной кислоты FAD, карбонильной группой остатка Gly10, боковымрадикалом и амидной группой остатка Thr16, что поддерживает структуруα-спирали 12-23. Однако боковой радикал данного остатка располагается вполости, которая сформирована боковыми группами остатков Val11, Thr16,Cys193, Asn325, Ala328, Gly332, Met339 и фосфатной группой FAD. Кроме того,исходя из рентгеноструктурных данных, в данной полости находятся по крайнеймере 3 молекулы кристаллизационной воды, которые с одной сторонысольватируют отрицательно заряженные остатки фосфорной кислоты, а с другойстороны могут отрицательно влиять на температурную стабильность TvDAAO,поскольку находятся внутри белковой глобулы.Остаток Ser31 не является консервативным, однако у многих DAAO, в томчисле у RgDAAO, в этом положении встречаются остатки Ala.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
