Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Для более выяснения причины эффектастабилизации в случае замены E32R/F33D, нами была изучена кинетикатермоинактивации в отсутствии и в присутствии экзогенного FAD дляTvDAAO E32R/F33D и TvDAAO дикого типа. Для этого к образцу фермента сначальной концентрацией 10 мкг/мл добавляли 100-кратный молярный избытокFAD и инкубировали при температуре 56°С. Как следует из полученныхзависимостей остаточной активности от времени инкубации на рис 4.53,добавление экзогенного FAD повышает температурную стабильность как ферментадикого типа, так и мутантной TvDAAO E32R/F33D.190T = 56 oC, [E]0 = 10 мкг/млОстаточная активность, A/Ao1,0wt-TvDAAOwt-TvDAAO+100X C(FAD)TvDAAO E32R/F33DTvDAAO E32R/F33D+100X C(FAD)0,80,60,40,20,0050100150200250300Время, минАoT = 56 C, [E]0 = 10 мкг/мл0,0-0,5ln(A/Ao)-1,0-1,5-2,0wt-TvDAAOwt-TvDAAO+100X C(FAD)TvDAAO E32R/F33DTvDAAO E32R/F33D+100X C(FAD)-2,5-3,0-3,5050100150200250300Время, минБРис.
4.53. Кинетика термоинактивации TvDAAO в присутствии экзогенного FAD. А –зависимостиостаточнойактивностиотвремени,аппроксимациябиэкспоненциальными функциями, Б - зависимости остаточной активности отвремени в полулогарифмических координатах, аппроксимация линейнымифункциями. TvDAAO E32R/F33D (▲,─), TvDAAO E32R/F33D+100x FAD( ,─ ─), wt-TvDAAO (■,─), wt-TvDAAO+100x FAD ( ,─ ─). Концентрацияферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температура инкубации 56°С.191Поскольку оба фермента при повышенных температурах инактивируются всоответствии с диссоциативным механизмом, а при добавлении FAD такженаблюдаются изломы на зависимостях остаточной активности от времени вполулогарифмическихкоординатах(рис 4.53Б),тонамибылосделанопредположение, что механизм термоинактивации TvDAAO не изменяется вприсутствии экзогенного FAD.
Для оценки количественного эффекта повышениятемпературной стабильности, нами были рассчитаны константы скорости дляобеих стадий процесса термоинактивации, а также периоды полуинактивации вприсутствии и в отсутствии экзогенного FAD для TvDAAO E32R/F33D и ферментадикого типа (табл. 4.28). Анализ данных показывает, что добавление FAD влияетна обе стадии процесса термоинактивации.
Для фермента дикого типа k1 снижаетсяпочти в 11 раз, а k2 снижается в 3,3 раза, период полуинактивации возрастает почтив 21 раз. Для TvDAAO E32R/F33D k1 снижается почти в 12 раз, а k2 уменьшаетсявсего в 1,2 раза, при этом период полуинактивации возрастает в 12 раз.
Следовательно, добавление экзогенного FAD в одинаковой степени стабилизирует обафермента на первой стадии термоинактивации (диссоциация димера на неактивныемономеры), в то время как на второй стадии процесса (диссоциация FAD изактивного центра и разворачивание белковой глобулы) эффект стабилизации дляTvDAAO дикого типа в 2,7 раза выше, чем для TvDAAO E32R/F33D. Разница вувеличении периодов полуинактивации составляет почти 2 раза.Таблица 4.28.Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации и периодыполуинактивации TvDAAO E32R/F33D и TvDAAO дикого типа при добавленииэкзогенного 100-кратного молярном избытка FAD (концентрация ферментов 10мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0).Форма TvDAAOТемпература,°СПараметр56 (+FAD)56Дикий типE32R/F33DKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1τ1/2Kdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1τ1/26,011,67,17,22,155,32,15391920,421,072,181500,080,431,75480Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать вывод, чтоувеличение температурной стабильности TvDAAO при введении замены E32R/F33Dв структуру фермента в FAD-связывающем домене, по-видимому, происходит засчет усиления связывания кофактора FAD белковой глобулой TvDAAO.4.3.5.
Каталитические свойства мутантных TvDAAO с заменами вкофермент-связывающем доменеДля всех активных и стабильных мутантных TvDAAO и фермента дикоготипа были получены профили субстратной специфичности. Для этого былиопределены константы Михаэлиса (КМ) и каталитические константы (kcat) сразличными D-аминокислотами.
Кроме того, для каждого субстрата быларассчитана каталитическая эффективность фермента – отношение величины kcat кКМ. Полученные экспериментальные данные приведены в таблицах 4.29 и 4.30. Длянаглядности зеленым цветом и полужирным шрифтом выделено улучшениесоответствующего кинетического параметра по сравнению с ферментом дикоготипа. Поскольку мутантная TvDAAO F33D была активна только в нерастворимойформе, то для изучения ферментативной кинетики этого мутанта использовалисуспензию разрушенных клеток. Определение kcat для этого мутанта непредставлялось возможным, поскольку не существует метода определенияконцентрации активных центров TvDAAO, связанной с клеточной мембраной.Поэтому в случае TvDAAO F33D были определены только значения КМ сразличными D-аминокислотами.Для наглядности сравнения на рис.
4.54-4.57 представлены относительныезначенияконстантМихаэлиса(КМmut/КМwt·100%),каталитическихконстант(kcatmut/kcatwt·100%), каталитической эффективности ((kcat/KМ)mut/(kcat/KМ)wt·100%), атакже абсолютные значения каталитической эффективности (kcat/KМ) для мутантныхTvDAAO и фермента дикого типа.Из таблиц 4.29, 4.30 и рис. 4.54-4.57 следует, что введение различных замен в32 и 33 положение в FAD связывающем домене TvDAAO привело к получениюмутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности.193Все мутантные ферменты имеют повышенную каталитическую эффективность сD-Leu, неактивны c D-Lys, а с D-Thr активны только TvDAAO E32R/F33D иTvDAAO E32Q/F33D.ДлямутантовнаблюдаетсяснебольшойточечнымиростаминокислотнымизначенийKМизаменаминекотороевцеломуменьшениекаталитической активности с большинством D-аминокислот, что в конечном итогиприводит к более низкой каталитической эффективности.
Исключением являетсятолько TvDAAO F33H, для которой значения KМ уменьшились с D-Leu (в 2,6 раза)и D-Phe (в 2,1 раза), а значения kcat выросли с D-Met (1,15 раза), D-Val (1,5 раза),D-Leu (1,3раза) и D-Tyr (1,9 раза). Также следует отметить, что у нерастворимогомутанта с TvDAAO F33D наблюдается улучшение величины КМ практически совсеми изученными субстратами.ДлядвойныхмутантовE32R/F33Dи E32Q/F33Dследуетотметитьследующие моменты:TvDAAO E32Q/F33D обладает более низкими значениями KМ только с D-Leu(в 2,4 раза), D-Ser (в 1,3 раза) и D-Phe (в 1,5 раза), однако каталитическая активностьвыросла со многими субстратами от 1,1 до 1,6 раза (табл. 4.30, рис. 4.54, 4.55).TvDAAO E32R/F33D по сравнению с ферментом дикого типа имеет болеевысокую каталитическую активность со всеми субстратами (рост в среднем от 1,2до 1,6 раза), за исключением D-Ser. Значения KМ немного увеличились c D-Met,D-Ala и D-Val, однако с остальными субстратами значения KМ уменьшились илипрактически не изменились.
В результате данный фермент имеет увеличеннуюкаталитическую эффективность с D-Ala (в 1,2 раза), D-Leu (в 3,8 раза), D-Ser (в 1,3раза), D-Phe (в 2,0 раза), D-Tyr (в 1,2 раза), D-Trp (в 1,4 раза), D-Asn (в 1,5 раза),D-Thr (в 1,3 раза), и только с D-Met данный параметр уменьшился в 1,3 раза за счетнебольшогоувеличениязначенияKМ.Такимобразом,мутантнаяTvDAAO E32R/F33D в целом обладает улучшенными каталитическими свойствамипо сравнению с ферментом дикого типа и, кроме того, является наиболееэффективным ферментов среди всех изученных мутантов с заменами в областиFAD-связывающего домена TvDAAO.194Таблица 4.29.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами E32Q, E32R, F33D и фермента дикого типа.Форма TvDAAOДикий типСубстратD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-LysKM, мМkcat, с-10,46±0,0316,7±0,714,4±1,20,78±0,0237±40,37±0,040,45±0,060,49±0,0422,6±1,511,1±0,829,3±3,481±1109±285±329,1±0,320,5±0,927,2±0,822,5±1,942,4±1,462±21,75±0,043,54±0,21E32Qkcat/ KM,мМ-1с-11756,55,9370,567450872,80,160,12E32RKM, мМkcat, с-11,65±0,0623,8±1,618,7±1,10,27±0,0241,0±6,00,52±0,0382±237,1±1,132,6±0,915,9±0,513,2±1,021,0±0,5н.д.**22,1±1225,9±1,6н.д.н.д.0,49±0,0618,0±2,0kcat/ KM,мМ-1с-149,41,561,7458,90,3240,445,11,44KM, мМkcat, с-12,23±0,1326,2±1,417,6±1,40,26±0,0232,3±2,20,39±0,020,48±0,040,59±0,0516,9±1,682±385±358,3±1,812,4±0,311,9±0,416,9±0,312,6±0,626,8±0,921,2±1,2н.д.н.д.F33Dkcat/ KM,мМ-1с-136,73,23,347,10,3743,526,145,71,26KM, мМ0,95±0,046,5±0,64,7±0,50,16±0,0324,2±3,50,50±0,050,19±0,020,31±0,0517,9±1,3нет активности18,9±2,1Таблица 4.30.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами F33H, F33S, E32Q/F33D и E32R/F33D.Форма TvDAAOF33HСубстратKM, мМF33Skcat, с-1kcat/ KM,мМ-1с-1993,35,01290,3615038,053,12,1KM, мМE32Q/F33Dkcat, с-1kcat/ KM,мМ-1с-167,62,43,062,7KM, мМkcat, с-1E32R/F33Dkcat/ KM,мМ-1с-1145,96,55,41190,4912147,369,22,260,14KM, мМkcat, с-1kcat/ KM,мМ-1с-11347,86,51430,7414757,81224,160,200,78±0,0652,7±1,80,80±0,030,75±0,02D-Met0,93±0,0792±2117±2100±219,7±0,7D-Ala17,0±2,056,1±4,126,0±2,063,1±2,125,8±1,0168±4154±320,0±2,060,3±2,419,1±1,917,8±0,8D-Val25,0±3,0125±10104±4115±213,8±0,3D-Leu0,30±0,0238,7±0,90,22±0,010,32±0,0238,0±0,60,27±0,0238,7±0,313,7±0,317,8±0,5D-Ser51,0±5,018,4±1,0нет активности27,8±1,524,0±1,726,4±0,812,2±0,253,1D-Phe0,18±0,010,23±0,020,25±0,0230,2±0,50,26±0,0238,2±0,30,71±0,1322,2±2,731,30,44±0,0220,8±0,60,46±0,03D-Tyr1,10±0,341,8±8,226,6±0,90,54±0,02D-Trp0,48±0,0525,5±1,00,59±0,0627,1±0,946,00,77±0,0553,3±1,566,1±2,015,5±0,91,722,4±1,550,7±1,6D-Asn28,0±4,058,2±0,49,4±0,919,0±1,679±4D-Thrнет активностинет активности13,4±1,41,82±0,0610,5±1,22,12±0,07D-Lysнет активностинет активностинет активностинет активности* - Зеленым фоном и полужирным шрифтом выделено случаи улучшения каталитических параметров мутантных TvDAAO по сравнению с таковыми для фермента дикого типа** - нет данных195Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
