Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Замена М9образуется из М8 добавлением точечной замены F54S. Таким образом, нами былорешено получить 9 многоточечных мутантных TvDAAO, которые далее длякраткости будут обозначаться M1-M9.2054.4.2. Получение мутантных TvDAAO с многоточечными заменамиОбъединение замен в 32/33, 54 и 108 положениях (мутанты М1-М4) былопроведено с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые несут мутациюE32R/F33D в гене tvdaao (см. главу 4.3), поскольку расположение уникальныхсайтов рестрикции не позволяет выполнить переклонирование участков генов смутациями. В качестве ДНК матриц для проведения ПЦР, рестрикции (по сайтамNcoI и Bsp119I) и лигирования использовали ранее полученные плазмиды смутантными генами tvdaao, которые обеспечивают замены C108F, F54A/C108F,F54S/C108F, F54Y/C108F в структуре TvDAAO (табл.
4.31).Таблица 4.31.Олигонуклеотидные праймеры для введения мутаций в ген tvdaao.МатрицаC108F,F54A/C108F,F54S/C108F,F54Y/C108FЗаменаНуклеотидная последовательность*5’- A ATT GTG TCC AGG GAT ACG CCC GGT GATE32R/F33DMfor CTT AGT ATC -3’5’- GGC GTA TCC CTG GAC ACA ATT GTA ACC TCAMrev TGT CC - 3’5'- GAA GGT GCC TTC TCG GCC ATC TTC CAA CGCMfor AAC -3'M104F5'- GAA GAT GGC CGA GAA GGC ACC TTC CAG TTTMrev AGG AAG -3'5'- GGT GCC ATG GCG GCC ATC TTC CAA CGC AACE32R/F33D/C108FMfor -3'S105A5'- GAA GAT GGC CGC CAT GGC ACC TTC CAG TTTMrev AGG -3'5'- GGT GCC TTC GCG GCC ATC TTC CAA CGC AACM104F/S105AMfor -3'5'- GAT GGC CGC GAA GGC ACC TTC CAG TTT AGGMrev AAG -3'* Полужирным шрифтом выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутации.Объединение замен в 32/33, 104, 105 и 108 положениях в описанных вышекомбинациях (мутантны М5-М7) было проведено с помощью ПЦР, поскольку вэтом случае переклонирование участков генов с мутациями из исходных плазмидбыло также невозможно из-за близкого расположения вводимых замен в генtvdaao.
Для ПЦР использовали праймеры, несущие замены M104F, S105A иM104F/S105A в гене tvdaao. В качестве ДНК-матрицы для генно-инженерных206манипуляций использовали полученную на первом этапе объединения плазмиду,которая содержит тройную замену E32R/F33D/C108F (табл. 4.31).Объединение замен в 32/33, 54 и 104 положениях (мутантны М8-М9) былопроведено с помощью переклонирования участков генов, которые содержаттриплеты, обеспечивающие замены E32R/F33D, F54S и M104F. Для этогоиспользовали ранее полученные плазмиды с мутантными генами tvdaaopTvDAAO E32R/F33D(см. главу 4.3),pTvDAAO M104FИзсоответствующихpTvDAAO E32R/F33D/F54S/C108F.(см.
главу 4.1)плазмидивырезалиучастки гена с мутациями E32R/F33D и E32R/F33D/F54S с помощью рестриктазNcoI и EcoRI и проводили лигирование в вектор pTvDAAO M104F, из которого спомощью тех же рестриктаз предварительно был удален соответствующийфрагмент без мутации.Во всех случаях наличие необходимых многоточечных мутаций, а такжеотсутствие посторонних мутаций, было подтверждено с помощью секвенирования.Получение штаммов-продуцентов мутантных TvDAAO, культивирование,экспрессию, выделение и очистку проводили аналогично методикам, описанным вглаве 4.1.
В процессе культивирования и экспрессии все многоточечные мутантныеTvDAAO M1-M9 синтезировались в активной и растворимой форме. Выходымутантных ферментов и фермента дикого типа по активности сильно отличаютсядруг от друга, однако коррелируют с удельной активностью по D-метионину вкаждомслучае(табл. 4.32).Стоитотметить,чтообъединениеточечныхаминокислотных замен в многоточечные замены не приводит к уменьшениюуровня экспрессии растворимых белков по сравнению с ферментом дикого типа.Все ферменты являлись достаточно стабильными, были выделены и очищены спомощью анионообменной хроматографии на колонке MonoQ с последующимобессоливанием на колонке G25. Результаты очистки и параметры образцовмутантных ферментов, которые были использованы для изучения свойств,представлены в таблице 4.32. В целом за две стадии очистки наблюдаются болеевысокие выходы для мутантных ферментов, чем для фермента дикого типа, чтоможет быть связано с более высокой стабильностью многоточечных мутантов.207Аналитический SDS-электрофорез очищенных образцов мутантных TvDAAO ифермента дикого типа в полиакриламидном геле представлен на рис.
4.59 и 4.60.Все препараты TvDAAO M1-M9 имели чистоту не менее 95%.После получения высокоочищенных препаратов мутантных TvDAAO смноготочечными аминокислотными заменами М1-М9 нами были изучены ихсвойства – субстратная специфичность и температурная стабильность.Таблица 4.32.Результаты экспрессии (в клетках E.coli) и очистки многоточечных мутантныхTvDAAO М1-М9 и фермента дикого типа.КультивированиеОчисткаВыход поВыходКонцент- УдельнаяактивностОтношениераств.рация активностьи послепоглощенияфермента, фермента,фермент,ссы, г/лочистки,A280/A455Ед/л*мг/ла, мкг/млЕд/мг%ВыходФормаВыходTvDAAO биома- активногоДикий тип15,3118008455951408,3M115,319800133821561498,8M212,9920011583145808,5M313,248008978155548,9M415,546008195119579,4M513,292009786182957,7M613,91280095711361358,2M715,31190096881631248,9M813,51010081801091259,0M913,968007685155899,4*Активность ферментов определяли по D-метионину208Рис.
4.59. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO М1, 2 –TvDAAO М2, 3 – TvDAAO М3, 4 – TvDAAO М4, 5 – TvDAAO дикого типа, M– маркер (мол. массы указаны в кДа).Рис. 4.60. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO М5, 2 –TvDAAO М6, 3 – TvDAAO М7, 4 – TvDAAO М8, 5 – TvDAAO М9, 6 –TvDAAO дикого типа, M – маркер (мол.
массы указаны в кДа).2094.4.3. Каталитические свойства многоточечных мутантных TvDAAOКаталитические свойства были подробно изучены для многоточечныхмутантных TvDAAO M1-M4, которые содержат замены в активном центрефермента. Подробное изучение профилей субстратной специфичности длямутантных TvDAAO M5-M9 не входило в задачи данной работы, поэтому для этихферментов были изучены каталитические свойства с основным субстратомD-метионином.
Экспериментальные данные были обсчитаны согласно методикам,которые описаны в главе 4.1. Результаты определения констант Михаэлиса (КМ),каталитические констант (kcat) и значения каталитической эффективности сразличными D-аминокислотами приведены в таблице 4.33. Для наглядностизеленым цветом и полужирным шрифтом выделено улучшение соответствующегокинетического параметра по сравнению с ферментом дикого типа. На рис. 4.61представлена диаграмма, на которой приведены значения каталитическойэффективности ((kcat/KМ)mut/(kcat/KМ)wt·100%) для мутантных TvDAAO относительнотаковых для фермента дикого типа (приняты за 100%).Из таблицы 4.33 и рис.
4.61 следует, что многоточечные мутантныеTvDAAO M1-M4 и фермент дикого типа имеют различные профили субстратнойспецифичности. Для всех мутантов наблюдается уменьшение каталитическойактивности с небольшими субстратами D-Ala, D-Val и D-Ser, а с D-Thr активностьполностью отсутствует. В случае объемных алифатических и ароматическихсубстратов, как правило, наблюдается улучшение, по крайней мере, одного из каталитических параметров (КМ или kcat) этих мутантов по сравнению с таковыми дляфермента дикого типа.
По каждому отдельному многоточечному мутантномуферменту в сравнении с ферментом дикого типа можно выделить следующиемоменты:TvDAAO M1 обладает повышенной каталитической активностью с D-Met (в1,2 раза), D-Phe (в 2,3 раза), D-Asn (в 1,7 раза) и D-Lys (в 2,1 раза). Значения КМнемного уменьшились с D-Leu, D-Ser, D-Tyr и D-Asn, но с остальными субстратамивозросли в 1,5-5,8 раза.
Профиль субстратной специфичности TvDAAO M1210определяется заменой C108F, но в целом фермент активнее, чем TvDAAO C108F,за счет положительного влияния замены E32R/F33D.TvDAAO M2 имеет более высокую каталитическую активность с D-Phe (в 3,6раза), D-Tyr (в 2,2 раза), D-Trp (в 1,2 раза) и D-Lys (в 2,8 раза). Значения КМулучшились с D-Leu (в 8 раз), D-Tyr (в 1,5 раза), D-Asn (в 5,9 раза) и D-Lys (в 1,8раза).
Также произошло уменьшение значений КМ с D-Ala, D-Val, D-Ser от 2 до 10раз, однако значения kcat уменьшились от 10 до 20 раз, что соответствующимобразом повлияло на значениях каталитической эффективности с этимисубстратами. Этот фермент обладает самой высокой kcat с D-Phe, самой высокойkcat/КМ с D-Leu и D-Asn среди полученных мутантов. Тем не менее, значения КМухудшились с D-Met (в 3,1 раза), D-Phe (в 2,6 раза) и D-Trp (в 2,0 раза).TvDAAO M3 обладает более высокой каталитической активностью с D-Phe (в2,9 раза), D-Tyr (в 1,9 раза), D-Asn (в 1,2 раза) и D-Lys (в 2,4 раза).
Наблюдаетсяулучшение КМ с D-Leu (в 10 раз), D-Tyr (в 2,2 раза), D-Asn (в 4,2 раза) и D-Lys (в1,7 раза). С D-Ala, D-Val, D-Ser в 2-3 раза уменьшились значения КМ и сильноупала каталитическая активность. Кроме того, значения КМ увеличились с D-Met (в2,6 раза), D-Phe (в 3,9 раза) и D-Trp (в 2,5 раза).TvDAAO M4 имеет повышенную каталитическую активность с D-Phe (в 3,4раза), D-Tyr (в 2,3 раза) и D-Lys (в 2,3 раза). Фермент практически не проявляетактивность с D-Ala, D-Val, D-Ser, как и TvDAAO M2-M3. Кроме того, произошлоувеличение значений КМ с D-Met (в 2,8 раза), D-Phe (в 4,7 раза) и D-Trp (в 2,1 раза).Таким образом, многоточечные мутантные TvDAAO M1-M4 имеют похожиепрофили субстратной специфичности, но при этом мутанты TvDAAO M2-M4имеют более высокую каталитическую эффективность, чем TvDAAO M1.
Спектрсубстратной специфичности каждого мутанта в первую очередь определяютсязаменами F54A, F54S и F54Y и C108F в активном центре фермента, при этомзамена E32R/F33D вносит положительный вклад в каталитическую активностьпрактически со всеми субстратами. Например, с D-аминокислотами, которыеявляются “хорошими субстратами”, все мутантные ферменты TvDAAO M1-M4имеют более высокую активность, чем их общий предшественник TvDAAO C108F,211а также чем TvDAAO F54Y (TvDAAO F54A не был изучен в силу очень низкойстабильности). Исключением является TvDAAO M3, которая с некоторымисубстратами хоть и активнее, чем TvDAAO C108F, но в то же время обладаетменьшей активностью, чем TvDAAO F54S, что по-видимому является следствиемвведения замены C108F.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
