Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Стоит отметить, что при объединении несколькихпространственно-удаленных друг от друга точечных замен в многоточечныемутантные TvDAAO, аддитивное влияние каждой отдельной замены на значенияКМ и kcat наблюдается не с каждым субстратом.Исходяизабсолютныхзначенийкаталитическихконстантkcat,представленных в таблицы 4.33, наиболее перспективными для окислительногодезаминированияотдельныхD-аминокислот,можновыделитьмутантыTvDAAO M1 для окисления D-Phe и D-Asn, TvDAAO M2-M4 для окисления D-PheиD-Tyr.Несмотрянато,чтоTvDAAO M1-M4имеютповышеннуюкаталитическую эффективность с D-Leu и D-Lys, эти ферменты не являютсяперспективными для окисления этих субстратов в силу невысоких абсолютныхзначений каталитических констант kcat.Поскольку D-Met является основным субстратом для измерения активностиTvDAAO, то для выбора насыщающей концентрации при изучении температурнойстабильности, были изучены каталитические свойства для многоточечныхмутантных TvDAAO M5-M9 с этой D-аминокислотой (в сравнении с ферментомдикого типа):TvDAAO M5 КМ=4,2 мМ (возросла в 9 раз), kcat=62 с-1 (уменьшилась в 1,3 раза)TvDAAO M6 КМ=3,1 мМ (возросла в 6,7 раза), kcat=88 с-1 (возросла в 1,1 раза)TvDAAO M7 КМ=3,5 мМ (возросла в 7,7 раза), kcat=81 с-1 (не изменилась)TvDAAO M8 КМ=3,95 мМ (возросла в 8,5 раз), kcat=82 с-1 (не изменилась),TvDAAO M9 КМ=2,03 мМ (возросла в 4,4 раз), kcat=58 с-1 (уменьшилась в 1,3 раза),Таким образом, для мутантов TvDAAO M5-M9 с D-Met наблюдаетсяувеличение значений КМ, однако каталитическая активность практически неизменяется.
Стоит отметить, что для многоточечных мутантных TvDAAO M5-M9наблюдается корреляция с каталитическими параметрами исходных мутантныхTvDAAO c точечными аминокислотными заменами M104F, S105A и C108F.212Таблица 4.33.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами M104A, M104S, M104V и фермента дикого типа.Форма TvDAAOСубст-Дикий типратKM, мМkcat, с-1D-Met0,46±0,0381±1D-Ala16,7±0,7D-ValM1kcat/ KM,KM, мМkcat, с-11752,68±0,0898±2*109±26,551±314,4±1,285±35,9D-Leu0,78±0,0229,1±0,3D-Ser37±4D-PheM2kcat/ KM,KM, мМkcat, с-1361,44±0,0452±131±10,617,8±0,61*39±237±10,95370,58±0,0120,7±0,920,5±0,90,5632±30,37±0,0427,2±0,874D-Tyr0,45±0,0622,5±1,9D-Trp0,49±0,04D-AsnM3kcat/ KM,KM, мМkcat, с-1361,23±0,0635,3±0,65,8±0,20,747,8±0,94,6±0,55,0±0,21,104,5±0,6360,09±0,0126,3±0,62805,5±0,20,173,7±0,62,07±0,060,6н.д.**1,08±0,0763±2580,96±0,0698±3100500,18±0,0211,2±0,5640,30±0,0349±342,4±1,4870,79±0,0927,6±1,3350,98±0,0722,6±1,562±22,816,0±0,3107±16,73,8±0,2D-Thr11,1±0,81,75±0,040,16D-Lys29,3±3,43,54±0,210,12мМ-1с-1мМ-1с-1нет активности48±97,3±0,916±2kcat/ KM,kcat/ KM,KM, мМkcat, с-128,81,29±0,0937±1293,45±0,130,446,4±1,03,09±0,130,482,86±0,100,645,0±0,92,47±0,130,490,07±0,01 11,9±0,261700,09±0,0111,5±0,21301,07±0,04н.д.7,4±2,61,60±0,140,221,44±0,0879±2551,73±0,1192±2531600,21±0,0143±22050,36±0,0352±315049±2501,22±0,0723,8±0,919,51,04±0,1123,1±1,522,265±2175,5±0,272±113,04,7±0,368±214,6мМ-1с-1нет активности0,15M49,9±0,3мМ-1с-1нет активности0,6117,3±1,88,4±0,4мМ-1с-1нет активности0,4812,4±1,48,0±0,30,64* - Зеленым фоном и полужирным шрифтом выделено случаи улучшения каталитических параметров мутантных TvDAAO по сравнению стаковыми для фермента дикого типа** - нет данных213Рис.
4.61. Относительные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для многоточечных мутантных TvDAAO M1-M4 и ихпредшественников с заменами E32R/F33D, F54S, F54Y, C108F. За 100% принята каталитическая эффективность фермента дикоготипа с каждой D-аминокислотой.2144.4.4. Температурная стабильность многоточечных мутантных TvDAAOТемпературнуюстабильностьвсехмноготочечныхмутантныхTvDAAO M1-M9 изучали по кинетике термоинактивации, как было описано впредыдущих главах.
Сравнение температурной стабильности мутантов и ферментадикого типа проводили при одинаковой начальной концентрации ферментов иразличной температуре. На рис. 4.62 и рис. 4.63 представлены зависимостиостаточной активности от времени для TvDAAO M1-M4 при температуре 56°С идля TvDAAO M5-M9 при температуре 60°С. Концентрация ферментов во всехслучаях10 мкг/мл,биэкспоненциальнымиэкспериментальныефункциями.Дляданныеаппроксимированыподтверждениядиссоциативногомеханизма термоинактивации также были получены зависимости остаточнойактивности от времени при различных начальных концентрациях ферментов.
Вкачестве примера на рис. 4.64 и рис. 4.65 представлены типичные зависимостиостаточной активности от времени для TvDAAO M1 в полулогарифмическихкоординатах при различных температурах (52-62°С) и начальных концентрацияхфермента (5, 10, 15 и 20 мкг/мл). Наличие точек излома и зависимость скоростиинактивации от начальной концентрации фермента указывают на двухстадийныйдиссоциативный механизм (см. главу 4.1).
Такого рода зависимости былиполученыдлявсехмутантныхформTvDAAOсмноготочечнымиаминокислотными заменами. В результате, для каждого мутанта было показано,что механизм термоинактивации при повышенных температурах не изменился,несмотря на то, что стабильность в некоторых случаях сильно возрослаотносительно фермента дикого типа. Это может быть связано с тем, что всеисходные точечные замены располагаются вне области межсубъединичногоконтакта в димере TvDAAO.
Следовательно, данные замены не могут приводить ксущественной стабилизации димерного состояния фермента и, в конечном счете, кодностадийному механизму термоинактивации по реакции первого порядка.215T = 56 oC, [E]0 = 10 мкг/млОстаточная активность, A/Ao1,0wt-TvDAAOTvDAAO M1TvDAAO M2TvDAAO M3TvDAAO M40,80,60,40,20,0020406080100120140160Время, минРис. 4.62. Зависимости остаточной активности от времени мутантных TvDAAO M1 (▲,─),TvDAAO M2 (▼,─), TvDAAO M3 (◄,─), TvDAAO M4 (►,─) и TvDAAOдикого типа (■,─). Экспериментальные данные аппроксимированыбиэкспоненциальными функциями. Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 МКФБ, рН 8,0, температура инкубации 56 °С.T = 60 oC, [E]0 = 10 мкг/млОстаточная активность, A/Ao1,0wt-TvDAAOTvDAAO E32R/F33DTvDAAO M104FTvDAAO M5TvDAAO M6TvDAAO M7TvDAAO M8TvDAAO M90,80,60,40,20,0020406080100120140160Время, минРис. 4.63.ЗависимостиостаточнойактивностиотвременимутантныхTvDAAO E32R/F33D (●,─), TvDAAO M104F (▲,─), TvDAAO M5 (▼,─),TvDAAO M6 (►,─), TvDAAO M7 (◄,─), TvDAAO M8 (♦,─), TvDAAO M9(▼,─) и TvDAAO дикого типа (■,─).
Экспериментальные данныеаппроксимированыбиэкспоненциальнымифункциями.Концентрацияферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температура инкубации 60 °С.216[E]0 = 10 мкг/мл (const)0ln(A/Ao)-1-2-3o54 Co56 Co58 Co60 Co62 C-4-5020406080100120140160Время, минРис.
4.64. Зависимости остаточной активности от времени мутантной TvDAAO M1 вполулогарифмическихкоординатахприразличныхтемпературах.Концентрация фермента 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температура 54 °С(●,─), 56 °С (▲,─), 58 °С (▼,─), 60 °С (♦,─) и 62 °С (◄,─).oT = 56 C (const)0,0ln(A/Ao)-0,5-1,0-1,55 мкг/мл10 мкг/мл15 мкг/мл20 мкг/мл-2,0-2,5020406080100120140Время, минРис. 4.65.
Зависимости остаточной активности от времени мутантной TvDAAO M1 вполулогарифмических координатах при различных начальных концентрацияхфермента. Температура 56 °С, 0,1 М КФБ, рН 8,0, концентрации фермента –5 мкг/мл (◄,─), 10 мкг/мл (▼,─), 15 мкг/мл (▲,─) и 20 мкг/мл (■,─).217ДляподробногосравнениястабильностимутантныхTvDAAOиколичественной оценки аддитивности влияния точечных замен на стабильностьфермента, исходя из экспериментальных данных (рис. 4.62-64), были рассчитанызначения констант скорости первой и второй стадии инактивации, а также периодыполуинактивации для всех мутантных TvDAAO (табл.
4.34, 4.35).Анализ полученных данных показал, что многоточечные мутанты, как и ихточечные предшественники стабильнее фермента дикого типа. По каждойотдельнойгруппемноготочечныхмутантныхTvDAAOможноотметитьследующие моменты:TvDAAO M1-M4:Изтаблицы 4.34видно,чтодлямутантныхTvDAAO M1-M4 значения констант скорости термоинактивации как на первой, таки на второй стадиях понизились по сравнению со своими точечнымипредшественниками (табл.4.34, для F54S см. табл.4.18, для F54Y см. [57]).
Для всехмутантов температурный диапазон по сравнению с таковым для TvDAAO дикоготипа сдвинулся на два градуса в сторону более высоких температур (с 50-60°С на52-62°С). Между собой ферменты имеют близкую стабильность, однаконаибольший стабилизационный эффект наблюдается в случае тройного мутантаTvDAAO M1 (табл.4.34, 4.35).
Стоит отметить, что для точечного мутантаTvDAAO C108F эффект стабилизации связан в первую очередь с уменьшениемконстантскоростипервойстадииинактивации,втовремякакдляTvDAAO E32R/F33D наблюдается снижение констант скоростей обеих стадийинактивации. При объединении этих двух замен в TvDAAO M1 наблюдаетсяаддитивность этих эффектов.Оценку эффекта аддитивности проводили аналогично тому, как описано вглаве 4.2 (пункт 4.2.4). При 56°С для обоих мутантов TvDAAO E32R/F33D имутанта TvDAAO C108F константа скорости инактивации на первой стадии упалав 2,2 раза (на 54%) в сравнении с таковой для фермента дикого типа, а приобъединении этих замен в мутант TvDAAO M1 константа скорости падает в 4 раза(на 75%).
На второй стадии для TvDAAO E32R/F33D значение k2 понизилось в 3,3раза (на 70%), для TvDAAO C108F снизилось в 1,4 раза (почти на 28%), а для218TvDAAO M1 упало в 3,6 раза (на 73%). Данные расчетов, представленные втаблице 4.36, говорят о том, что при объединении замен E32R/F33D и C108F вмноготочечныймутант,напервойивторойстадияхтермоинактивацииаддитивность влияния двух мутаций составляет около 80-82% (k1 упала в 4 раза, атеоретически должны была снизиться в 2,2×2,2=4,8 раза; k2 упала в 3,6 раза, атеоретическидолжнабыласнизитьсяв3,3×1,4=4,6раза).Посколькутемпературные зависимости констант скоростей обеих стадий инактивации длявсех мутантных TvDAAO и фермента дикого типа отличаются друг от друга, тоэффект аддитивности может отличать при различных температурах.
Однако вцелом экспериментальные данные подтверждают изначальное предположение отом, что эффекты от пространственно-удаленных замен в структуре ферментасуммируются между собой. При переходе от мутанта TvDAAO M1 к мутантамTvDAAO M2-M4 за счет введения дополнительных замен F54A, F54S, F54Y вактивный центр фермента наблюдается снижение температурной стабильностиотносительно TvDAAO M1. Данный факт также указывает на сложение эффектовот точечных замен, поскольку TvDAAO F54S и TvDAAO F54Y обладали болеенизкой температурной стабильностью, чем фермент дикого типа. Интереснымявляется то, что замена F54A приводила к сильной дестабилизации белковойглобулы и мутантная TvDAAO F54A полностью инактивировалась в процессевыделения из клеток [57].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
