Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 36
Текст из файла (страница 36)
4.63, табл. 4.34 и 4.35). На основе рассчитанных константскоростей инактивации был рассчитан эффект аддитивности объединенияточечных замен при 56°С. Наблюдаемые эффекты стабилизации (αпрак) следующие:M8 (E32R/F33D/M104F) – k1 упала в 6,4 раза (на 84%), k2 упала в 5,8 раза (на83%)M9 (E32R/F33D/F54S/M104F) – k1 упала в 5,3 раза (на 81%), k2 упала в 5 раз(на 80%)Теоретическиезначенияэффектастабилизации(αтеор)длямноготочечных мутантов исходя из уменьшения констант скоростей для точечныхзамен следующие:M8 (E32R/F33D/M104F) – k1: 2,2×5,3=11,7 раза (на 91,5%), k2: 3,3×4,0=13,2раза (на 92,4%)M9 (E32R/F33D/F54S/M104F) – k1: 2,2×0,95×5,3=11,1 раза (на 90%), k2:3,3×0,92×4,0=12,3 раза (на 82%)Такимобразомаддитивностьприобъединенииточечныхзаменвмноготочечные в каждом случае следующая (табл. 4.36):E32R/F33D+M104F 1 стадия – 55%, 2 стадия – 43%E32R/F33D+F54SF+M104F 1 стадия – 47%, 2 стадия – 41%Стоит отметить, что полученные значения аддитивности для мутантов M8-M9несколько ниже, чем для TvDAAO M1.
Однако при объединении замен E32R/F33D224и M104F в многоточечный мутант наблюдается дополнительная стабилизацияотносительносоответствующиходноточечныхмутантов.Такимобразом,полученные мутанты M8 и M9 оказываются намного стабильнее, чем ферментдикого типа. Например, при 60°С период полуинактивации TvDAAO M8 составляет28 минут, для TvDAAO M104F – 14 минут, а для фермента дикого типа 2,7 минуты(табл.
4.35).Еслиферментдикоготипаприэтихусловияхполностьюинактивируется за 20 минут, то TvDAAO M8 через 150 минут инкубации сохраняетоколо 20% активности (рис. 4.63) Исходя из полученных данных, можно сделатьвывод о том, что мутантная TvDAAO M8 на данный момент является самойтермостабильной из мутантных и природных оксидаз D-аминокислот, описанных влитературе.Таблица 4.36.Расчет параметров αэксп, αтеор и аддитивности для мутантных TvDAAO при 56°С.Форма TvDAAO1 стадия2 стадияk1αэкспαтеор%k2αэкспαтеор%Дикий тип11,61--7,11--TvDAAO E32R/F33D5,32,2--2,153,3--TvDAAO F54S12,20,95--7,70,92--TvDAAO F54Y10,01,2--6,01,2--TvDAAO M104F2,175,3--1,764,0--TvDAAO S105A5,42,1--5,81,2--TvDAAO C108F5,32,2--5,11,4--TvDAAO M12,924,04,8831,953,64,679TvDAAO M23,383,4--4,771,5--TvDAAO M33,853,04,6663,142,34,253TvDAAO M45,12,35,6412,642,75,450TvDAAO M54,832,4269,42,912,41913TvDAAO M63,873,010292,502,8651TvDAAO M72,654,4558,02,762,62311,3TvDAAO M81,806,411,7551,235,813,343TvDAAO M92,205,311,1471,425,012,341225wt-TvDAAOTvDAAO M1TvDAAO M8TvDAAO M9-11ln(k1/T)-12-13-14-15-160,002950,003000,003050,003100,00315-11/T, KАwt-TvDAAOTvDAAO M1TvDAAO M8TvDAAO M9-11ln(k2/T)-12-13-14-15-160,002950,003000,003050,003100,00315-11/T, KБРис.
4.66. Температурные зависимости констант скорости первой (k1/T от 1/T, А) и второй(k2/T от 1/T, Б) стадий термоинактивации для мутантных TvDAAO M1 (▲,─),TvDAAO M8 (♦,─), TvDAAO M9 (▼,─)и TvDAAO дикого типа (■,─).Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0.226ДлянаиболеемутантовTvDAAO M1,TvDAAO M8ибыли проанализированы температурные зависимости константTvDAAO M9скоростейстабильныхпервойивторойстадийтермоинактивациивобратныхполулогарифмических координатах ТАК (рис. 4.66). Из данных зависимостейхорошо видно, что все три мутанта намного стабильнее TvDAAO дикого типа инаибольшейтемпературнойстабильностьюобладаетTvDAAO M8вовсемизученном температурном диапазоне. На первой и второй стадии процессатермоинактивации наклоны температурных зависимостей констант скорости дляTvDAAO M1 и TvDAAO M8 близки к соответствующим зависимостям для ферментадикого типа. Это говорит о том, что эффект стабилизации практические не меняетсяс температурой для TvDAAO M1 и TvDAAO M8.
Однако стоит отметить, что k1 вслучае TvDAAO M1 несколько быстрее падает с температурой, чем дляTvDAAO дикого типа, то есть эффект стабилизации на первой стадии немногорастет с понижением температуры. На общем фоне выделяется мутантнаяTvDAAO M9,посколькуконстантыскоростинаобеихстадияхпроцессатермоинактивации быстрее растут с температурой, чем для остальных ферментов,причем для второй стадии данный эффект наиболее значительный. Таким образом,эффект стабилизации увеличивается с понижением температуры и TvDAAO M9 посвоей стабильности становится сравним с TvDAAO M8 при температурах ниже 54°Сна обеих стадиях термоинактивации.Таким образом, в результате изучения оксидазы D-аминокислот из дрожжей T.variabilis с помощью метода рационального белкового дизайна было получено 40мутантных форм этого фермента. Данное исследование представляет собойсовокупность двух направлений, одно из которых заключается в изученииструктурно-функциональных взаимосвязей TvDAAO, чему были посвящены первыедве главы данной работы.
Целью таких исследований, как правило, является ненаправленное изменение или оптимизация свойств природного фермента, а поиск иизучение структурных особенностей, изучение влияния вводимых изменений вструктуру фермента на его свойства, что представляет собой фундаментальныйинтерес и ведет к более глубокому пониманию строения и механизма действия227различных ферментов. Однако подобные исследования часто приводят к самымнеожиданным результатам.
Другое направление, которому была посвящена втораяполовина данной работы, имеет сугубо прикладной характер и заключается вполучении мутантных форм TvDAAO с заданными свойствами. Стоит отметить, чтоизучая какую-либо структурную особенность или отдельный аминокислотныйостаток, его роль в структуре и свойствах TvDAAO, мы неизбежно получаеммутантные формы фермента c измененными свойствами.
С другой стороны, задачаполученияферментасзаданнымисвойствами,например,повышеннойтемпературной стабильностью или увеличенной каталитической активностью сопределенным субстратом, так или иначе сводится к подробному анализу структурыTvDAAO с целью поиска перспективных положений, замены в которых могутпривести к желаемому результату. Другими словами, изменения в структуре белкаведут к изменениям в его свойствах, а стремление получить желаемое свойство ведетк изменениям в структуре. Таким образом, фундаментальное и прикладноенаправления исследования оказываются тесно связанными между собой, что былонаглядно продемонстрировано в данной работе.
Так в результате изучениявзаимосвязи структуры и функции TvDAAO была получена мутантная формаферментасзаменойM104F,котораяобладалазначительноповышеннойтермостабильностью. В рамках работы по оптимизации кофермент-связывающегодоменасцельюTvDAAO E32R/F33DусиленияссвязыванияувеличеннойFADбылаполученатермостабильностьюимутантнаякаталитическойактивностью со многими субстратами.
В результате TvDAAO E32R/F33D былаположена в основу для дальнейшего получения мутантных форм TvDAAO сулучшенными свойствами, вместо фермента дикого типа, поскольку в практикебелковой инженерии такая задача, как правило, решается путем объединениянескольких успешных точечных замен, каждая из которых в отдельности можетиметь умеренное влияние на активность и стабильность фермента, в то время какмноготочечные мутанты могут обладать значительно улучшенными свойствами посравнению с ферментом дикого типа. Заключительная глава посвящаласьобъединению наиболее успешных точечных аминокислотных замен, которые были228получены в рамках данной работы, а также другими исследователями в нашейлаборатории.ВрезультатебылиполученытермостабильныемутантныеTvDAAO M1-M4, обладающие узким спектром субстратной специфичности иповышенной каталитической активностью с ароматическими D-аминокислотами,что может быть использовано для селективного определения D-Phe и D-Tyr, а такжедля их окисления в тонком органическом синтезе.
Наиболее выдающиеся результатыбыли достигнуты в повышении температурной стабильности TvDAAO. Объединениезамен E32R/F33D и M104F, которые были изучены в данной работе, привело кувеличению температурной стабильности TvDAAO более, чем в 10 раз. МутантнаяформаTvDAAOE32R/F33D/M104Fнаданныймоментявляетсясамойтермостабильной оксидазой D-аминокислот, как среди природных ферментов, так исреди ранее полученных мутантов.
Комбинация замен E32R/F33D и M104F сдополнительной заменой F54S в активном центре фермента, которая определяетспектр субстратной специфичности всех многоточечных мутантов, привела также кполучению термостабильной TvDAAO. Многоточечные мутантные TvDAAO,полученные в данной работе, могут быть весьма перспективными для применения вкачестве биокатализаторов в процессах органического синтеза с использованиемоксидаз D-аминокислот. Однако в ближайшей перспективе необходимо провестиизучение каталитических свойств многоточечных мутантов с наиболее важнымбиотехнологическим субстратом цефалоспорином С.
Кроме того, необходимоизучить влияние термообработки бесклеточных экстрактов после разрушения клетокна стабильность и каталитическую активность многоточечных TvDAAO приразличных температурах. Данные эксперименты позволят подобрать оптимальнуютемпературу и ввести дополнительную стадию термообработки при выделении, чтоможет привести к существенному упрощению очистки TvDAAO и повышениювыхода активного фермента. В заключении хочется отметить, что данная работапродемонстрировала, что рациональный дизайн является мощным методом как дляизучения структурно-функциональных взаимосвязей в белках, так и для получениямутантных форм ферментов с улучшенными и оптимизированными свойствами дляцелей биотехнологии.229V. ВЫВОДЫ1.Проведено систематическое исследование взаимосвязи структуры и функцииоксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis с помощью методарационального белкового дизайна.
В ходе работы было получено 40мутантных фермента с аминокислотными заменами в области активногоцентра и FAD-связывающего домена TvDAAO.2.Изучена роль соединительной петли 95-120 и остатка Met104, которыйрасположен на входе в активный центр TvDAAO. Показано, что данныйструктурный элемент и остаток Met104 играют исключительно важную роль вкаталитических свойствах и температурной стабильности TvDAAO. Введение10 различных замен в данное положение привело к изменению спектрасубстратной специфичности фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
