Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Однако при комбинации этой замены с заменамиE32R/F33D и C108F, многоточечный TvDAAO M2 оказывается стабильнеефермента дикого типа. Также стоит отметить, что в целом многоточечныеTvDAAO M2-M4 с заменами в активном центре обладают очень близкойтемпературной стабильностью между собой, а также со своими точечнымипредшественникам (табл.
4.34 и 4.35).219Таблица 4.34.Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации мутантных TvDAAO ифермента дикого типа (концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0)*.ФормаTvDAAOПараметр4850Температура,°С545658527606264Kdis·10 , M-**0,191,271,346,09,314,6k1·104, c-12,863,679,211,621,541k2·104, c-12,283,135,67,110,819,4Kdis·107, M0,410,941,102,155,4715,24 -12,033,034,175,37,813,1E32R/F33D k1·10 , ck2·104, c-11,141,501,832,153,225,8Kdis·107, M1,101,361,973,163,864 -1k·10,c1,532,173,406,410,020,01M104Fk2·104, c-11,071,762,314,579,219,3Kdis·107, M0,74 1,29 1,436,211,54 -1k1·10 , c2,43 3,375,412,6 21,9S105A4 -1k2·10 , c2,48 3,445,87,29,77Kdis·10 , M0,38 0,34 0,48 0,53 0,64 0,804 -1k·10,c1,33 1,55 4,235,39,818,01C108F4 -1k2·10 , c2,10 2,66 3,505,112,2 20,07Kdis·10 , M0,901,162,548,315,120,64 -1k·10,c0,881,092,925,910,227,31M14 -1k2·10 , c0,971,041,952,685,210,87Kdis·10 , M0,330,850,943,54,6k1·104, c-11,522,583,45,98,3M2k2·104, c-11,332,484,85,110,07Kdis·10 , M0,390,891,904,135,012,04 -1k1·10 , c0,881,883,859,814,634M3k2·104, c-11,282,333,147,012,620,6Kdis·107, M0,330,762,557,112,5374 -1k·10,c2,003,125,17,114,622,21M4k2·104, c-11,372,082,643,767,918,0Kdis·107, M0,731,704,8010,415,14 -1k1·10 , c2,474,8310,213,729,3M5k2·104, c-11,962,915,56,918,17Kdis·10 , M0,691,133,216,7334 -1k·10,c2,373,876,011,716,31M6k2·104, c-11,672,503,285,08,7Kdis·107, M0,831,284,204,3712,9k1·104, c-11,302,655,811,627,1M7k2·104, c-11,482,763,187,716,07Kdis·10 , M0,520,632,023,0410,84 -1k·10,c1,803,075,58,113,0M814 -1k2·10 , c1,232,172,915,17,57Kdis·10 , M0,831,563,165,69,5k1·104, c-12,205,49,021,646M9k2·104, c-11,422,445,0711,536*Ошибка эксперимента составляла не более 15%, **параметр не определяли из-за очень малого илиочень большого значения констант, ***уменьшение параметров термоинактивации мутантныхTvDAAO по сравнению с ферментом дикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном.Дикий тип220Таблица 4.35.Периоды полуинактивации мутантных TvDAAO и фермента дикого типа(концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0)*.τ1/2, мин.; температура,°СФормаTvDAAO485052545658606264Дикий тип-7347237,24,72,7--E32R/F33D-300**135102***39177,5--M104F---107823714,08,14,7S105A--7435204,23,1--C108F-13895772714,86,1--M1---1504219,28,93,1-M2---843113,29,0--M3---79339,55,62,8-M4---8920,513,36,53,5-M5---90257,75,82,2-M6---1155316,68,14,0-M7---1244917,18,22,9-M8----1871012811,75,1M9----11136104,52,1* – ошибка эксперимента составляла не более 15%оцененные из данных по** – италиком отмечены периоды полуинактивации (τ1/2)термоинактивации при концентрации фермента не равной 10 мкг/мл***– увеличение периодов полуинактивации мутантных TvDAAO по сравнению с ферментомдикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном.
Более темный фонсоответствует большему эффекту.TvDAAO M5-M7 были получены для изучения влияния одновременноговведения нескольких замен в соединительную петлю 95-120. В основу всехмутантов была положена замена E32R/F33D, поскольку ее эффект стабилизацииаддитивен с эффектом от замены C108F в активном центре. Все три мутантаTvDAAO M5-M7 стабильнее, чем фермент дикого типа, при этом среди трехмутантов TvDAAO M5 является наименее стабильным ферментом, а TvDAAO M6и TvDAAO M7 по стабильности близки между собой (табл. 4.34 и 4.35). Стоитотметить, что все три мутанта TvDAAO M5-M7 по своей температурной221стабильности превосходят предшественников TvDAAO S105A и TvDAAO C108F,однако близки к TvDAAO E32R/F33D, и менее стабильны, чем TvDAAO M104F.Эффект аддитивности объединения точечных замен был проверен при 56°С наоснове данных таблицы 4.34. Результаты представлены в таблице 4.36. В случаеточечных замен и их объединения в многоточечные мутанты наблюдаютсяследующиеэффектыстабилизации(αпрак)накаждойстадиипроцессатермоинактивации относительно фермента дикого типа:E32R/F33D – k1 упала в 2,2 раза (на 54%), k2 упала в 3,3 раза (на 70%)F54S – k1 и k2 немного возросли (αпрак=0,95 и 0,92 соответственно)F54Y – k1 и k2 упали примерно в 1,2 раза (на 16,5%)M104F – k1 упала в 5,3 раза (на 81%), k2 упала в 4 раза (на 75%)S105A – k1 упала в 2,1 раза (на 53%), k2 упала в 1,2 раза (на 18%)C108F – k1 упала в 2,2 раза (на 54%), k2 упала в 1,4 раза (на 28%)M5 (E32R/F33D/M104F/C108F) – k1 упала в 2,4 раза (на 58%), k2 упала в 2,4раза (на 58%)M6 (E32R/F33D/S105A/C108F) – k1 упала в 3 раза (на 67%), k2 упала в 2,8 раза(на 65%)M7 (E32R/F33D/M104F/S105A/C108F) – k1 упала в 4,4 раза (на 77%), k2 упалав 2,6 раза (на 61%)Теоретическиезначенияэффектастабилизации(αтеор)длямноготочечных мутантов исходя из уменьшения констант скоростей для точечныхследующие:M5 (E32R/F33D/M104F/C108F) – k1: 2,2×5,3×2,2=26 раз (на 96%), k2:3,3×4×1,4=18,5 раза (на 94,5%)M6 (E32R/F33D/S105A/C108F) – k1: 2,2×2,1×2,2=10,2 раза (на 90%), k2:3,3×1,2×1,4=5,5 раза (на 82%)M7 (E32R/F33D/M104F/S105A/C108F) – k1: 2,2×5,3×2,1×2,2=55 раза (на 98%),k2: 3,3×4×1,2×1,4=23 раза (на 95,5%)222Таким образом, как следует из рассчитанных эффектов стабилизации αпрак иαтеор, аддитивность ((αпрак/αтеор)×100,%) при объединении точечных замен вмноготочечные в каждом случае следующая (табл.
4.36):E32R/F33D+M104F+C108F 1 стадия – 9,5%, 2 стадия – 13%E32R/F33D+S105A+C108F 1 стадия – 29%, 2 стадия – 51%E32R/F33D+M104F+S105A+C108F 1 стадия – 8,0%, 2 стадия – 11%Полученные данные говорят о том, что при объединении трех замен M104F,S105A, C108F, которые располагаются в соединительной петле 95-120 с заменойE32R/F33Dвкофермент-связывающемдомененаблюдаетсяоченьнизкаяаддитивность. Например, при объединении E32R/F33D+M104F+S105A+C108F вTvDAAO M7 константа скорости второй стадии инактивации k2 теоретическидолжна была уменьшиться в 23 раза, но снизилась всего лишь в 2,6 раза.
Данныйэффект, по-видимому, связан с взаимным влиянием замен M104F, S105A и C108Fдруг на друга, поскольку при объединении E32R/F33D и C108F наблюдаетсяпрактически полная аддитивность эффектов стабилизации. Каждая из замен M104F,S105A, C108F в отдельности может приводить к гидрофобизации неупорядоченногоучастка с 95 по 120 остаток, заполнению полостей в области активного центра,усилению взаимодействия с соседними аминокислотными остатками и элементамивторичной структуры, экранированию активного центра от растворителя и т.д.,однако одновременно все три замены не дают аддитивного положительногоэффекта.
Сильнее всего это проявляется при одновременном введении замен M104Fи C108F (самая низкая аддитивность в случае мутантов М5 и М7) в структуруTvDAAO, т.е. двух остатков Phe в область активного центра фермента, чтовозможно нарушает правильное расположения этих остатков. Возможно врезультате нарушается ориентация вводимого остатка Phe в 104 положение,который, как было показано в главе 4.2 взаимодействует с остатками Phe54 иPhe258, что в конечном счете не дает такого большого эффекта стабилизации, как вслучае точечной замены M104F.Все вышесказанное позволяет сделать вывод о том, что для достижениявысокой аддитивности эффектов стабилизации необходимо проводить объединение223замены в FAD-связывающем домене E32R/F33D с одной из трех замен M104F,S105A, C108F в соединительной петле в районе активного центра.
Для проверкиданного предположения и получения мутантной TvDAAO с еще большейтемпературной стабильность было выполнено объединение замен E32R/F33D иM104F (TvDAAO M8). Кроме того, было проведено объединение замен E32R/F33D,F54S, M104F (TvDAAO M8), поскольку, как было показано ранее в главе 4.2,введение замены F54S в дополнение к замене M104F не приводит к сильномуснижению температурной стабильности TvDAAO.TvDAAO M8-M9 по своей температурной стабильности значительнопревосходятферментдикоготипа,атакжевсесвоиодноточечныепредшественники (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
