Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Для подтверждения этого, нами была изучена кинетикатермоинактивации всех мутантных TvDAAO при различных температурах иначальных концентрациях ферментов. В качестве примера на рис. 4.48 и 4.49приведены экспериментальные зависимости остаточной активности от времени вполулогарифмических координатах для TvDAAO E32R/F33D при температурах50-60°С и начальных концентрациях фермента 7-40 мкг/мл. Наличие точек изломана данных зависимостях, а также увеличение тангенса угла наклона второголинейногоучасткаприуменьшенииначальнойконцентрацииферментаподтверждает, что термоинактивация протекает по диссоциативному механизму.Подробное изучение данного механизма было изложено в главе 4.1.183[E]0 = 7,0 мкг/мл (const)0,0ln(A/Ao)-0,5-1,0o-1,550 Co52 Co54 Co56 Co58 Co60 C-2,0-2,5-3,0020406080100120140160Время, минРис.
4.48. Зависимости остаточной активности от времени для мутантной TvDAAOE32R/F33D в полулогарифмических координатах при различныхтемпературах. Концентрация фермента 7,0 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0,температура 50 °С (■,─), 52 °С (●,─), 54 °С (▲,─), 56 °С (▼,─), 58 °С (♦,─),60 °С (◄,─).oT = 56 C (const)0,0ln(A/Ao)-0,540 мкг/мл-1,020 мкг/мл-1,515 мкг/мл7 мкг/мл-2,002040608010012010 мкг/мл140160180Время, минРис. 4.49. Зависимости остаточной активности от времени для мутантной TvDAAOE32R/F33D в полулогарифмических координатах при различных начальныхконцентрациях фермента.
Температура 56 °С, 0,1 М КФБ, рН 8,0,концентрации фермента – 7,0 мкг/мл (♦,─), 10,0 мкг/мл (◄,─), 15 мкг/мл(▼,─), 20 мкг/мл (▲,─), 40 мкг/мл (■,─).184Таким образом, термоинактивация мутантных TvDAAO протекает в двестадии и зависимости остаточной активности от времени описываются суммойдвухэкспоненциальныхфункций(рис. 4.50и4.51).Сиспользованиемматематического аппарата теории диссоциативной инактивации [167] нами былирассчитаны значения констант скорости первой и второй стадии инактивации длявсех мутантных TvDAAO (табл.
4.26). Анализ данных показывает, что в случаевведения замен E32Q, E32R, F33H, F33S, E32Q/F33D произошло увеличениеконстант скоростей первой и второй стадии термоинактивации и снижениетемпературнойстабильностиTvDAAO.Такжепроизошлосмещениетемпературных диапазонов, в которых реализуется диссоциативный механизмтермоинактивации, от 2 до 10°С в область более низких температур. Однако вслучае двойной замены E32R/F33D удалось достичь существенного повышениятемпературной стабильности (рис. 4.51, табл.
4.26). Таким образом, мутантныеTvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене можно расположить повозрастанию стабильности в следующем порядке: F33S, E32R, F33H, E32Q/F33D,E32Q, фермент дикого типа, E32R/F33D. Период полуинактивации при 54°С иначальной концентрации фермента 10 мкг/мл для фермента дикого типа составляет23 минуты, в то время как для TvDAAO E32R/F33D это значение составляет уже102 минуты, т.е. более чем в 4 раза выше (рис. 4.51).
Также стоит отметить, что дляTvDAAO E32R/F33D в среднем происходит уменьшение констант скорости обеихстадий от 1,5 до 4 раз по сравнению с таковыми значениями для фермента дикоготипа, причем данный эффект увеличивается с температурой. Исходя из значенийконстант скоростей обеих стадий инактивации, можно сделать вывод, что введениезамены E32R/F33D стабилизирует как каждую отдельную субъединицу, так идимерное состояние TvDAAO, что происходитвызываемыхконформационныхизменений,усилению межсубъединичного контакта.185вероятнее всего за счеткоторыемогутспособствоватьT = 50 oC, [E]0 = 10 мкг/млОстаточная активность, A/Ao1,0wt-TvDAAOTvDAAO E32RTvDAAO F33HTvDAAO F33S0,80,60,40,20,0020406080100120Время, минРис. 4.50.
Зависимости остаточной активности от времени для мутантных TvDAAO сзаменами E32R (●,─), F33H (►,─), F33S (◄,─) и TvDAAO дикого типа (■,─).Экспериментальных данные аппроксимированы биэкспоненциальнымифункциями. Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0,температура инкубации 50°С.T = 54 oC, [E]0 = 10 мкг/млОстаточная активность, A/Ao1,0wt-TvDAAOTvDAAO E32QTvDAAO E32Q/F33DTvDAAO E32R/F33D0,80,60,40,20,0020406080100120140160Время, минРис.
4.51. Зависимости остаточной активности от времени для мутантных TvDAAO сзаменами E32Q (♦,─), E32Q/F33D (▼,─),E32R/F33D (▲,─) и TvDAAO дикоготипа(■,─).Экспериментальныхданныеаппроксимированыбиэкспоненциальными функциями. Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 МКФБ, рН 8,0, температура инкубации 54°С.186Таблица 4.26.Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации мутантных TvDAAO сзаменами в FAD-связывающем домене и фермента дикого типа (0,1 М КФБ, рН 8,0)*.ФормаТемпература,°СПараметрTvDAAO444648505254565860Дикий типKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-**---0,192,862,281,273,673,131,349,25,66,011,67,19,321,510,814,64119,4E32QKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1----2,02***4,481,953,4212,43,636,118,96,68,13817,8-E32RKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-12,263,983,295,96,94,85,518,58,716,920,812,5-----F33HKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-11,001,601,271,892,071,693,625,22,974,113,35,86,71913,2----F33SKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-12,297,85,46,815,07,113,3239,7213220-----E32Q/F33DKdis·107, Mk1·104, c-1k2·104, c-1-1,262,282,292,104,603,452,546,64,810,412,031,143,1820,510,20,943,031,505,24121,61,104,171,8311,262402,155,32,155,477,83,2215,213,15,8Kdis·107, M4 -1E32R/F33D k1·10 , c4 -1k2·10 , c* – ошибка эксперимента составляла не более 15%** – параметр не определяли из-за очень малого или очень большого значения констант*** – уменьшение параметров термоинактивации мутантных TvDAAO по сравнению с ферментомдикого типа выделено полужирным шрифтом и зеленым фоном, небольшое изменение –серым, увеличение – красным.
Более темный фон соответствует большему эффекту.ДлятрехнаиболеестабильныхмутантовTvDAAO E32R/F33D,TvDAAO E32Q/F33D и TvDAAO E32Q были проанализированы температурныезависимости констант скоростей первой и второй стадий термоинактивации вобратных полулогарифмических координатах ТАК (рис. 4.52). Видно, что в случаеTvDAAO E32R/F33Dконстантыскоростиобеихстадийтермоинактивациинаходятся ниже, чем соответствующие значения для фермента дикого типа во всемтемпературном диапазоне от 50 до 60°С. Стоит отметить, что значения k1 и k2 дляTvDAAO E32R/F33D не так сильно зависят от температуры, чем таковые дляфермента дикого типа, что выражается в увеличении эффекта стабилизации с187ростом температуры на обеих стадиях инактивации. Для двойного мутантаTvDAAO E32Q/F33D зависимости k1 и k2 лежат выше таковых для фермента дикоготипа, т.е. данный фермент обладает меньшей стабильностью во всем изученномтемпературном диапазоне.
На общем фоне выделяется мутантная формаTvDAAO E32Q, поскольку у этого фермента константы скорости обеих стадийтермоинактивации растут быстрее, чем для остальных ферментов. Это отличиеособенно заметно в случае k2 (рис. 4.52Б). Из анализа температурных зависимостейможно сделать вывод, что при температурах ниже 52°С данный ферментстановится более стабильным, чем TvDAAO дикого типа.
Используя теориюактивированного комплекса (ТАК) и зависимости представленные на рис. 4.52,были найдены активационные параметры – энтальпия и энтропия активации, атакже Аррениусовская энергия активации для первой и второй стадийтермоинактивации для мутантных TvDAAO c заменами E32Q, E32Q/F33D иE32R/F33D (табл.
4.27). Значения H#, S# и Ea соотносятся с положениемтемпературных зависимостей соответствующих констант скоростей и, по сути,являются их численным представлением. Полученные значения активационныхпараметровявляютсяхимическимидостаточнореакциямиивысокимихарактерныподлясравнениюпроцессов,собычнымисвязанныхсразворачиванием белковой глобулы.
Из данных таблицы 4.27. следует, что дляTvDAAO E32Q и TvDAAO E32Q/F33D произошло увеличение активационныхпараметров для обеих стадий термоинактивации, причем для второй стадии болеесущественно. Для мутантной TvDAAO E32R/F33D, напротив, наблюдаетсясущественноеуменьшениеактивационныхпараметровнаобеихстадиях.Изменение параметров инактивации может быть объяснено конформационнымиизменениями структуры TvDAAO, которые происходят в результате мутагенеза.Таким образом, в результате направленного мутагенеза аминокислотныхостатков Ala9, Ala12, Glu32 и Phe33 в FAD-связывающем домене TvDAAO, былаполучена мутантная форма TvDAAO E32R/F33D с повышенной температурнойстабильностью в среднем в 3-4 раза по сравнению с TvDAAO дикого типа.188-10wt-TvDAAOTvDAAO E32QTvDAAO E32Q/F33DTvDAAO E32R/F33Dln(k1/T)-11-12-13-14-150,003000,003050,003100,00315-11/T, KАwt-TvDAAOTvDAAO E32QTvDAAO E32Q/F33DTvDAAO E32R/F33D-11ln(k2/T)-12-13-14-150,003000,003050,003100,00315-11/T, KБРис.
4.52. Температурные зависимости констант скорости первой (k1/T от 1/T, А) и второй(k2/T от 1/T, Б) стадий термоинактивации для мутантных TvDAAO с заменамиE32Q (♦,─), E32Q/F33D (▼,─), E32R/F33D (▲,─) и TvDAAO дикиго типа (■,─).0,1 М КФБ, рН 8,0.189Таблица 4.27.Активационные параметры первой и второй стадий инактивации мутантныхTvDAAO с заменами в FAD-связывающем домене и фермента дикого типа (0,1 МКФБ, рН 8,0).1я стадия инактивации2я стадия инактивации#S ,S#,ФормаEa,Ea,H#,H#,Дж/(моль*Дж/(моль*кДж/молькДж/молькДж/молькДж/мольTvDAAOК)К)Дикий тип237±18420±40240±17185±11260±30187±10E32Q303±35620±100306±35321±30670±90324±30E32Q/F33D299±20620±60302±20254±20480±60256±20E32R/F33D156±10170±30159±10133±17130±30135±174.3.4.
Изучение влияния замены E32R/F33D на связывание FADКак было отмечено выше, диссоциация FAD из активного центра TvDAAOявляется одной из причин инактивации фермента при повышенных температурах.Следовательно, полученный стабилизационный эффект в случае введения заменыE32R/F33D может быть объяснен усилением связывания FAD в активном центрефермента. В частности, исходя из спектра поглощения TvDAAO E32R/F33D,фермента дикого типа, а также других мутантных TvDAAO, можно сделать вывод,что содержание FAD в активном центре TvDAAO E32R/F33D выше, чем у другихферментов (рис. 4.47, табл. 4.25).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
