Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 29
Текст из файла (страница 29)
В случае этого фермента выход поактивности в таблице 4.23 приведен для нерастворимого белка. Для всех мутантовнаблюдаются различные выходы растворимых ферментов по активности, чтонаиболее вероятно объясняется различным уровнем экспрессии и различнойудельной активностью с D-метионином.Для выбора наиболее перспективных мутантных TvDAAO для дальнейшейочистки и изучения свойств, нами были проведены эксперименты по изучениютемпературной стабильности на бесклеточных экстрактах для фермента дикоготипа и мутантных TvDAAO с заменами 9S, A9T, A12S, A12I, A12M, E32Q/F33D иE32R/F33D.ВTvDAAO M104F,качествесравненияпосколькутакжеданныйбылаферментиспользованаобладаеточеньмутантнаявысокойтемпературной стабильностью (см.
главу 4.1). Экспрессия и выделение этого176фермента были проведены параллельно с получением других мутантных TvDAAOи фермента дикого типа.Таблица 4.22.Олигонуклеотидные праймеры для введения мутаций в ген tvdaao в положения,соответствующие 9, 12, 32 и 33 остаткам в структуре TvDAAO.ЗаменаA9SA9TA12SA12IA12ME32QE32RF33DF33HF33SF33TНуклеотидная последовательность*Mfor 5’-G GCT AAA ATC GTT GTT ATT GGT TCC GGT GTT GCC GGT TTA ACT A-3’Mrev 5’-C GGC AAC ACC GGA ACC AAT AAC AAC GAT TTT AGC CAT GG -3’Mfor 5’-G GCT AAA ATC GTT GTT ATT GGT ACC GGT GTT GCC GGT TTA ACT A-3’Mrev 5’-C GGC AAC ACC GGT ACC AAT AAC AAC GAT TTT AGC CAT GG -3’Mfor 5’-GGT GCC GGT GTT TCC GGT TTA ACT ACA GCT CTT CAA C -3’Mrev 5’-GC TGT AGT TAA ACC GGA AAC ACC GGC ACC AAT AAC AAC G -3’Mfor 5’-GGT GCC GGT GTT ATC GGT TTA ACT ACA GCT CTT CAA CTT C -3’Mrev 5’-G AGC TGT AGT TAA ACC GAT AAC ACC GGC ACC AAT AAC AAC G -3’Mfor 5’-GGT GCC GGT GTT ATG GGT TTA ACT ACA GCT CTT CAA CTT C -3’Mrev 5’-G AGC TGT AGT TAA ACC CAT AAC ACC GGC ACC AAT AAC AAC G -3’Mfor 5’- CA ATT GTG TCC CAG TTT ACG CCC GGT GAT CTT AG -3’Mrev 5’- GG CGT AAA CTG GGA CAC AAT TGT AAC CTC ATG TCC -3’Mfor 5’- CA ATT GTG TCC AGG TTT ACG CCC GGT GAT CTT AG -3’Mrev 5’- GG CGT AAA CCT GGA CAC AAT TGT AAC CTC ATG TCC -3’Mfor 5’- GTG TCC GAG GAT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC -3’Mrev 5’- C GGG CGT ATC CTC GGA CAC AAT TGT AAC CTC ATG -3’Mfor 5’- GTG TCC GAG CAT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC -3’Mrev 5’- C GGG CGT ATG CTC GGA CAC AAT TGT AAC CTC ATG -3’Mfor 5’- GTG TCC GAG TCT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC -3’Mrev 5’- C GGG CGT AGA CTC GGA CAC AAT TGT AAC CTC ATG -3’Mfor 5’- GTG TCC GAG ACT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC -3’Mrev 5’- C GGG CGT AGT CTC GGA CAC AAT TGT AAC CTC ATG -3’E32Q/F Mfor 5’-CA ATT GTG TCC CAG GAT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC GGA-3’33DMrev 5’- GGC GTA TCC TGG GAC ACA ATT GTA ACC TCA TGT CC - 3’E32R/F Mfor 5’- A ATT GTG TCC AGG GAT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC -3’33DMrev 5’- GGC GTA TCC CTG GAC ACA ATT GTA ACC TCA TGT CC - 3’* Полужирным шрифтом выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутации.177Таблица 4.23.Результаты экспрессии (в клетках E.coli) мутантных TvDAAO саминокислотными заменами в FAD-связывающем домене и фермента дикоготипа.Выход биомассы,г/лВыход активногофермента послекультивирования,Ед/л средыУдельнаяактивность,Ед/г биомассыДикий тип13,112500950A9S12,99900770A9T16,013700860A12S14,77800530A12I15,7168001070A12M15,313600890E32Q15,69700620E32R106200620F33D16,24000250F33H15,29900655F33S15,14300285F33T14,63600250E32Q/F33D16,19000560E32R/F33D14,39800680ФормаTvDAAO*Активность ферментов определяли по D-метионинуДля проведения эксперимента, бесклеточные экстракты соответствующихмутантных TvDAAO и фермента дикого типа разбавляли 0,1М калий-фосфатнымбуфером pH 8,0 до активности ~1 ед/мл по D-метионину и инкубировали при 56°Св течение 30 минут, после чего измеряли остаточную активность в образцах.Результаты эксперимента представлены в таблице 4.24.
В этих условия ферментдикого типа и TvDAAO M104F сохраняли около 35 и 80% активностисоответственно. Мутантные TvDAAO c заменами A9T, A12S, A12M и E32Q/F33Dполностьюпотерялиактивность,TvDAAO A9Sпрактическиполностьюинактивировалась, TvDAAO A12I сохранила около 7% активности, в то время как,TvDAAO E32R/F33D в этих условиях сохраняла около 55-60% активности. Стоитотметить, что подобного рода эксперимент является достаточно грубым, поскольку178удельная активность по D-метионину у всех мутантных ферментов и ферментадикого типа может отличаться друг от друга и, как следствие, концентрацииактивных ферментов также могут быть различными при начальных условияхэксперимента, т.е. при 1 ед/мл по D-метионину, а температурная стабильностьTvDAAO, как известно, зависит от начальной концентрации фермента. Тем неменее, такая большая разница в остаточных активностях мутантных TvDAAO ифермента дикого типа позволяет сделать вывод, что замена E32R/F33D с большойвероятностью приводит к повышению температурной стабильности TvDAAO.Также интересным является тот факт, что несмотря на сильную дестабилизациюTvDAAO в результате замен в 9 и 12 положениях, мутанты с заменами A9S и A12I,которые были выбраны исходя из сравнения последовательностей TvDAAO иRgDAAO, все же сохраняют некоторую активность после 30 минутной обработкипри 56°С.Таблица 4.24.Изучение температурной стабильности мутантных TvDAAO и фермента дикоготипа на бесклеточных экстрактах при 56 °С.ФормаTvDAAOАктивность,Ед/млt = 0 минАктивность,Ед/млt = 30 минОстаточнаяактивность, %Дикий тип0,98±0,030,36±0,0236,7M104F0,98±0,030,81±0,0282,7A9S1,02±0,03~ 0,01<1,0A9T0,95±0,0200A12S1,02±0,0300A12I0,97±0,020,07±0,017,2A12M0,96±0,0200E32Q/F33D0,98±0,0200E32R/F33D0,99±0,030,58±0,0258,5Таким образом, описанный выше эксперимент показал, что двойная заменаE32R/F33D, по-видимому, приводит к положительному стабилизирующемуэффекту и остатки в 32 и 33 положениях являются перспективными дляподробного изучения с помощью направленного мутагенеза.
Выбор точечныхзамен в этих положениях был описан выше в пункте 4.3.1. Итак, мутантные179TvDAAO с заменами E32Q, E32R, F33D, F33H, F33S, F33T, E32Q/F33D иE32R/F33D были выбраны для проведения дальнейших экспериментов –выделения, очистки и изучения свойств.В процессе выделения из клеток мутантная TvDAAO F33T полностьюинактивировалась в течение 10-15 минут. По-видимому, введение замены F33TприводитксущественнойдестабилизацииTvDAAO.ВслучаемутантаTvDAAO F33D активность отсутствовала в бесклеточных экстрактах послеразрушения клеток, но присутствовала в осадке клеточных стенок.
Этосвидетельствует о том, что мутантный фермент синтезируется в активной форме ввиде телец включения. Попытки перевести TvDAAO F33D в раствор не увенчалисьуспехом. Стоит отметить, что похожая ситуация наблюдалась нами ранее приполучении мутантных TvDAAO с заменами в области межсубъединичногоконтакта [51]. Для мутантных TvDAAO с заменами E32Q, E32R, F33H, F33S,E32Q/F33D и E32R/F33D была проведена очистка с помощью анионообменнойхроматографии на колонке MonoQ с последующим обессоливанием. Результатыочистки и параметры образцов TvDAAO, которые были использованы дляизучения свойств, представлены в таблице 4.25. Стоит отметить, что мутантныеTvDAAO E32R/F33D и TvDAAO E32Q/F33D имеют более высокую удельнуюактивность с D-метионином, чем фермент дикого типа.Таблица 4.25.Результаты очистки мутантных TvDAAO с аминокислотными заменами в 32 и 33положениях и фермента дикого типа.ОчисткаФорма TvDAAOВыход поактивности послеочистки, %Концентрацияфермента,мкг/млУдельнаяактивность,Ед/мгОтношениепоглощенияA280/A455Дикий типE32QE32RF33HF33SE32Q/F33DE32R/F33D654551753657621329875948762,080,0136124125140801781538,98,89,19,59,910,28,1*Активность ферментов определяли по D-метионину180Рис.
4.45. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO F33H, 2 –TvDAAO F33S, 3 – TvDAAO E32R/F33D, 4 – TvDAAO E32Q/F33D, 5 –TvDAAO E32R, 6 – TvDAAO E32Q, 7 – TvDAAO дикого типа, M – маркер(мол. массы указаны в кДа).Рис. 4.46. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после культивирования и разрушения клеток(1-4 нерастворимые фракции (осадок клеточных стенок), 5-8 растворимыефракции (бесклеточные экстракты). 1,5 – TvDAAO дикого типа, 2,6 –TvDAAO F33D, 3,7 – TvDAAO E32Q/F33D, 4,8 – TvDAAO E32R/F33D, M –маркер (мол. массы указаны в кДа).181Аналитический SDS-электрофорез в полиакриламидном геле показал, чтовсе препараты мутантных TvDAAO имели чистоту не менее 95% (рис.
4.45).Белковый электрофорез растворимых и нерастворимых фракций (бесклеточныеэкстракты и клеточный дебрис после разрушения клеток соответственно) длямутантных TvDAAO с заменами F33D, E32Q/F33D и E32R/F33D показал, что всеферменты присутствуют как в растворимой, так и нерастворимой формах(рис. 4.46) В случае замены F33D отсутствие активности фермента в растворе, повидимому, связано с дестабилизацией белковой глобулы. Стоит отметить, чтоколичество TvDAAO E32R/F33D в осадке гораздо меньше по сравнению с другимиобразцами TvDAAO.
Спектр поглощения TvDAAO E32R/F33D соответствуетспектру поглощения FAD-содержащих белков с максимумами на 280, 370 и 450 нми соотносится со спектром TvDAAO дикого типа (рис. 4.47). Соотношениепоглощения A280/A455 для TvDAAO E32R/F33D ниже, чем для остальных мутантови фермента дикого типа, что может говорить о более высоком содержании FAD вактивном центре этого фермента (табл. 4.25).3,5wt-TvDAAOTvDAAO E32R/F33DПоглощение3,02,52,01,51,00,50,0250300350400450500550600Длина волны, нмРис. 4.47. Спектры поглощения TvDAAO E32R/F33D (─) и фермента дикого типа (─) приконцентрации 1 мг/мл в диапазоне 250-600 нм.182Далее для полученных в очищенном виде мутантных TvDAAO и ферментадикого типа были изучены свойства – субстратная специфичность и температурнаястабильность.4.3.3.
Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами вкофермент-связывающем доменеВведение аминокислотных замен F33T и F33D в структуру TvDAAO привелок сильной дестабилизации фермента. Как было отмечено выше, мутантную формуTvDAAO F33T не удалось выделить и получить в чистом виде – ферментинактивировался при разрушении клеток. TvDAAO F33D был получен в активномвиде только в нерастворимой форме. Оказалось, что замена F33D привела ксильной дестабилизации молекулы белка – при 50°С фермент терял более 90%активности за 3 минуты. Причиной этого, как обсуждалось ранее, может являетсяпоявление двух отрицательно заряженных остатков в непосредственной близостидруг от друга в результате замены F33D, поскольку в соседнем 32 положениинаходится остаток Glu. Для остальных шести мутантных TvDAAO с заменамиE32Q, E32R, F33H, F33S, E32Q/F33D и E32R/F33D была изучена температурнаястабильность в различных температурных диапазонах по кинетике инактивации.Поскольку все замены выполнены вне области межсубъединичного контактав димере TvDAAO, то они не должны повлиять на механизм температурнойинактивации фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
