Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Результаты экспрессии представлены в таблице 4.14 всравнениисферментомдикоготипаимутантнымиTvDAAO F54SиTvDAAO F258S. Видно, что выходы растворимых ферментов как по активности,так и по массе в мг с литра среды, сильно отличаются друг от друга, что наиболее141вероятно объясняется различным уровнем экспрессии и различной удельнойактивностью с D-метионином.Таблица 4.14.Результаты экспрессии (в клетках E.coli) и очистки фермента дикого типа имутантных TvDAAO с двойными заменами в 54-104 и 104-258 положениях.КультивированиеФормаTvDAAOОчисткаВыходВыходВыходВыход по Концент- Удельная Отношебио- активногораств. активностирацияактив- ние поглмассы, фермента, фермента,послефермента, ность,ощенияг/лЕд/л*мг/лочистки, % мкг/млЕд/мг A280/A455Дикий тип15,3118008455951408,3F54S14,768006450891079,4F258S13,139406173154657,1F54S/M104S15,325007851118328,7F54S/M104F15,3870086951101019,3F54S/M104Y14,0230064801093611,1F54S/M104W15,3890013351102679,9M104F/F258S15,9940014584182658,1M104Y/F258S14,6550018380139308,5M104W/F258S13,547008491149568,2* - Активность ферментов определяли по D-метионинуАналитический SDS-электрофорез очищенных мутантных TvDAAO ифермента дикого типа в полиакриламидном геле показал, что все препараты имеличистоту не менее 95% (рис.
4.31, 4.32). Результаты очистки и параметры образцовмутантных TvDAAO, которые были использованы для изучения свойств,представлены в таблице 4.14. Стоит отметить, что удельная активность поD-метионину для всех мутантных TvDAAO с двойными заменами, как и для ихпредшественников, ниже, чем для фермента дикого типа. Наибольший выход поактивности наблюдался для TvDAAO F54S/M104F, что может быть связано с болеевысокой стабильностьюданногофермента.Послеполученияочищенныхпрепаратов нами были изучены их каталитические свойства и температурнаястабильность.142Рис.
4.31. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO F54S/M104F, 2 –TvDAAO F54S/M104Y, 3 – TvDAAO F54S/M104W, 4 – TvDAAO F54S/M104S,5 – TvDAAO дикого типа, M – маркер (мол. массы указаны в кДа).Рис. 4.32. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях препаратов TvDAAO после очистки. 1 – TvDAAO M104F/F258S, 2 –TvDAAO M104Y/F258S, 3 – TvDAAO M104W/F258S, 5 – TvDAAO дикоготипа, M – маркер (мол.
массы указаны в кДа).1434.2.3. Каталитические свойства мутантных TvDAAO с двойными заменамиРанее нами было показано, что введение замен F54S и F258S в активныйцентрферментаприводитксильномусужениюспектрасубстратнойспецифичности TvDAAO (табл. 4.15, рис. 4.33-36). Замена F54S приводила кполной потери активности с D-Ala, D-Val, D-Ser и D-Thr. Стоит отметить, чтосужение спектра субстратной специфичности сопровождалось значительнымувеличением каталитической эффективности с объемный субстратами: D-Leu (в 7раз), D-Phe (в 4,4 раза), D-Tyr (в 3,1 раза), D-Trp (в 2,4 раза), D-Asn (в 3,4 раза) иD-Lys (в 7,3 раза).
С D-Met каталитические свойства практически не изменились. Вслучае замены F258S наблюдалась несколько похожая картина – ферментполностью потерял активность с D-Ala, D-Ser, D-Thr, D-Lys и каталитическаяэффективность сильно упала с D-Val (в 24 раза) и D-Met (в 13,7 раз), но при этомвозросла с D-Leu (в 6,6 раз), D-Phe (в 4,7 раза) и D-Tyr (в 1,7 раза).Как было описано выше (см.главу 4.1), введение замен M104F, M104Y иM104W выражается в среднем в увеличении (ухудшении) значений Км собъемными субстратами и увеличении каталитической активности с небольшимисубстратами, что в конечном счете приводит соответствующему изменениюкаталитической эффективности.
Причем, объем вводимого остатка не играетосновнуюрольнаихудшимивформированиикаталитическимиспектрасвойствамисубстратнойсредитрехспецифичностимутантов–обладаетTvDAAO M104Y.При объединении замен F54S и M104S, M104F, M104Y, M104W в двойныезаменыF54S/M104S,F54S/M104F,F54S/M104Y,F54S/M104Wвслучаебольшинства субстратов наблюдается усреднение каталитических свойств, причемсам профиль субстратной специфичности, в первую очередь, определяетсяточечной заменой F54S (табл.
4.16, рис. 4.33-36). В сравнении с TvDAAO дикоготипа по каждому мутанту можно отметить следующие моменты:TvDAAO F54S/M104F имеет более высокие значения КM со многимисубстратами, что в первую очередь обусловлено заменой M104F. Однако значенияkcat выросли в случае D-Leu (в 1,5 раза), D-Phe (в 3,1 раза), D-Lys (в 5,4 раза),144возросла каталитическая эффективность с D-Leu (в 1,5 раза) и D-Lys (в 1,3 раза),при это практически полностью пропала активность с D-Ala, D-Val, D-Ser иполностью пропала с D-Thr, что, безусловно, определяется заменой F54S.TvDAAO F54S/M104Y практически неактивен с D-Ala, D-Val, D-Leu и D-Ser.Не проявляет активность с D-Thr. Имеет более высокую активность с D-Phe (в 2,1раза), D-Tyr (в 1,6 раза) и D-Lys (в 2,6 раза).
Каталитическая эффективностьвыросла только с D-Asn (в 1,5 раза) за счет уменьшения Км и с D-Lys (в 1,6 раза) засчет увеличения kcat. Имеет несколько повышенную активность с D-Phe и D-Tyr.TvDAAO F54S/M104W неактивен с D-Ser и D-Thr, сильно упала активность сD-Ala и D-Val. Характерной особенностью данного фермента является то, чтовлияние замены F54S главным образом выразилось в уменьшении значений Км, посравнению с TvDAAO M104W, но значения kcat при этом не увеличились. Какрезультат,наблюдаетсянекоторыйросткаталитическойэффективностиотносительно таковой для TvDAAO M104W с объемными субстратами.TvDAAO F54S/M104S является наименее активным двойным мутантом сомногими субстратами.
Замена F54S не приводит к улучшению каталитическойактивности, а лишь сужает спектр субстратной специфичности.При объединении замен M104F, M104Y, M104W с заменой F258S в двойныезамены M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S в случае большинствасубстратовнаблюдаетсяуменьшениезначенийКмпосравнениюспредшественниками, что связано не с отдельным, а совместным влияниемточечных замен в 104м положении и замены F258S (табл.
4.17, рис. 4.33-36).Однако стоит отметить, что двойные мутанты 104/258 имеют более узкий спектрсубстратный специфичности и немного увеличенные значения kcat с некоторымисубстратами, например с D-Leu и D-Phe, что главным образом, являетсярезультатом влияния замены F258S. Отдельно по каждому мутанту можновыделить следующие моменты в сравнении с TvDAAO дикого типа:TvDAAO M104F/F258S имеет повышенную активность с D-Leu (в 1,5 раза) иD-Phe (в 1,5 раза). На фоне снижения значений Км с некоторыми субстратами,145возросла каталитическая эффективность с D-Leu (в 2,2 раза).
Фермент неактивен сD-Thr, сильно снизилась активность с D-Ala, D-Val, D-Ser, D-Asn и D-Lys.TvDAAO M104Y/F258S имеет пониженную каталитическую активность совсеми изученными субстратами. Фермент неактивен с D-Thr. За счет снижениязначений Км, немного увеличилась каталитическая эффективность с D-Leu (в 2,1раза) и D-Phe (в 2,2 раза).TvDAAO M104W/F258S имеет пониженную активность с D-Ala, D-Val,D-Ser, D-Asn и D-Lys. Фермент неактивен с D-Thr.
Выросла каталитическойэффективности с D-Leu (в 1,2 раза) и D-Phe (в 1,4 раза).Исходяиздиаграммысабсолютнымизначениямикаталитическойэффективности (рис. 4.36), в целом можно констатировать, что введение заменF54S и F258S в дополнение к заменам M104F, M104Y, M104W приводит кувеличению каталитической эффективности с объемными субстратами (D-Met,D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Trp) и уменьшению активности с небольшими субстратами(D-Ala,D-Val,D-Ser)посравнениюссоответствующимиточечнымипредшественниками. Замены F54S и F258S определяют вид спектра субстратнойспецифичности двойных мутантов F54S/M104S, F54S/M104F, F54S/M104Y,F54S/M104W, M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S.
Кроме того, заменаF54S определяет активность двойных мутантов с D-Lys (рис. 4.34, 4.35). Стоитотметить, что для всех двойных мутантов, как и для TvDAAO F54S иTvDAAO F258S, лучшим субстратом является D-Phe. Таким образом, остатки в 54и 258 положениях оказывают большее влияние на каталитические свойства испектр субстратной специфичности фермента, чем остаток Met104.146Таблица 4.15.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами F54S, F258S и фермента дикого типа.Форма TvDAAOДикий типСубстратD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-LysKM, мМkcat, с-10,46±0,0316,7±0,714,4±1,20,78±0,0237±40,37±0,040,45±0,060,49±0,0422,6±1,511,1±0,829,3±3,481±1109±285±329,1±0,320,5±0,927,2±0,822,5±1,942,4±1,462±21,75±0,043,54±0,21F54SF258Skcat/ KM,kcat/ KM,KM, мМkcat, с-1мМ-1с-1мМ-1с-11750,39±0,0370±21806,5нет активности5,9нет активности370,13±0,02* 34,0±2,02600,56нет активности740,36±0,06116±11320500,50±0,0878±8160870,38±0,0279±22102,88,3±0,778±39,40,16нет активности0,1243±1238,0±5,00,9KM, мМkcat, с-13,3±0,342,0±2,0нет активности46±411,5±0,50,23±0,0156±1нет активности0,13±0,0147,1±0,90,84±0,1672±120,46±0,0231,0±0,750±314,8±1,3нет активностинет активностиkcat/ KM,мМ-1с-112,70,2525035086670,30Таблица 4.16.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами F54S/M104F, F54S/M104Y, F54S/M104W, F54S/M104S.Форма TvDAAOF54S/M104FСубстратKM, мМD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-Lyskcat, с-12,00±0,1066±24,5±0,11,50±0,109,9±0,32,60±0,300,75±0,05 42,3±1,0н.д.**2,0±0,22,05±0,1084±10,73±0,20 15,2±2,91,06±0,10 29,9±1,529,9±2,144,2±1,5нет активности125±4719,1±5,8F54S/M104Ykcat/ KM,мМ-1с-1333,03,857н.д.4120,8281,50,2KM, мМkcat, с-10,61±0,03 23,7±0,4н.д.2,00±0,10н.д.1,60±0,10н.д.2,00±0,1019,9±1,8 2,24±0,061,00±0,0557±0,91,50±0,25 35,0±4,70,64±0,08 23,8±1,441,9±0,810,2±0,5нет активности48±109,3±1,3F54S/M104Wkcat/ KM,мМ-1с-139н.д.н.д.н.д.0,115823,3374,100,19KM, мМkcat, с-10,57±0,03 43,8±0,93,70±0,30 3,70±0,1010,7±1,1 4,00±0,200,17±0,01 12,0±0,1нет активности0,23±0,01 17,5±0,30,39±0,05 13,7±1,00,31±0,04 19,5±0,812,1±0,58,8±0,9нет активности13,5±1,97,7±0,4147F54S/M104Skcat/ KM,мМ-1с-1KM, мМkcat, с-1kcat/ KM,мМ-1с-1771,020,38710,36±0,0410,0±1,0н.д.0,08±0,01580,19н.д.867635641,380,42±0,020,27±0,030,55±0,068,0±0,50,5714,6±1,221,1±0,61,97±0,080,80±0,057,1±0,2нет активности38,5±0,713,3±0,718,4±1,028,1±0,8нет активности9,8±0,49249333,50,67Таблица 4.17.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами M104F/F258S, M104Y/F258S, M104F/F258S и фермента дикого типа.Форма TvDAAOM104F/F258SСубстратKM, мМD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-Lyskcat, с-11,46±0,1142,7±1,139,5±2,422,3±0,722,6±0,510,2±0,60,28±0,0243,9±0,546,1±5,74,5±0,40,27±0,0243,3±0,715,7±0,70,34±0,030,71±0,0830,6±1,838,1±4,016,1±1,1нет активностин.д.0,46±0,04M104Y/F258Skcat/ KM,мМ-1с-129,20,562,211560,1015846,743,30,42н.д.KM, мМkcat, с-10,50±0,0619,7±0,628,6±2,37,5±0,326,8±1,35,8±0,123,1±0,40,45±0,0250,1±9,32,70±0,2719,1±0,20,18±0,018,0±0,40,25±0,010,5±0,40,36±0,0329,7±2,114,7±0,6нет активностин.д.0,29±0,03Дикий типM104W/F258Skcat/ KM,мМ-1с-139,10,260,22510,0510632,129,40,50н.д.KM, мМkcat, с-11,02±0,04 36,6±0,630,3±0,713,3±0,721,4±0,910,4±0,20,45±0,01 34,8±0,435,2±3,4 2,73±0,120,23±0,02 37,8±0,70,24±0,02 11,6±0,60,34±0,03 19,0±0,655,5±4,512,2±0,7нет активностин.д.0,50±0,05kcat/ KM,мМ-1с-136,02,270,48770,0816448,9560,22н.д.KM, мМkcat, с-10,46±0,0316,7±0,714,4±1,20,78±0,0237±40,37±0,040,45±0,060,49±0,0422,6±1,511,1±0,829,3±3,481±1109±285±329,1±0,320,5±0,927,2±0,822,5±1,942,4±1,462±21,75±0,043,54±0,21kcat/ KM,мМ-1с-11756,55,9370,567450872,80,160,12* – Зеленым фоном и полужирным шрифтом выделены случаи улучшения каталитических параметров мутантных TvDAAO по сравнению стаковыми для фермента дикого типа** – нет данных148Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
