Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 19
Текст из файла (страница 19)
В целом каталитическая эффективность снизилась сомногими субстратами за счет увеличения значений Км.TvDAAO M104Y имеет наименьшую каталитическую эффективность сомногими субстратами среди всех полученных мутантов в 104м положении. С D-Thrи D-Lys фермент неактивен. Улучшение наблюдается только в случае D-Ser (Кмснизилась в 1,5 раза, kcat выросла в 1,4 раза). Таким образом, введениегидроксильной группы, в сравнении с заменой M104F, приводит к еще большемуухудшению каталитической активности фермента.TvDAAO M104W имеет более низкую активность и более высокие значенияКм с ароматическими D-аминокислотами, с остальными субстратами активностьсравнима с таковой для дикого типа, однако в некоторых случаях наблюдаетсянекоторое падение каталитической эффективности за счет небольшого ростазначений Км.
С D-Thr и D-Lys фермент неактивен.Таким образом, введение объемных ароматических замен M104F, M104Y иM104W в среднем выразилось в увеличении значений Км с объемнымисубстратами и увеличении каталитической активности с небольшими субстратами,что в конечном счете привело к соответствующему изменению каталитическойэффективности. Замена M104L, с точки зрения влияния на каталитические105свойства, является чем-то средним между небольшими алифатическими заменами(хорошая активность с объемными субстратами) и ароматическими заменами(хорошая активность с небольшими субстратами).4.1.4.
Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами в 104положенииТемпературную стабильность мутантных TvDAAO изучали по кинетикетермоинактивации при различных температурах и начальных концентрацияхферментов. На рис. 4.12 представлены зависимости остаточной активностиполученных мутантов TvDAAO от времени при одинаковой концентрацииферментов (10 мкг/мл) и температуре 56°С. Как видно из рис. 4.12 замены M104A,M104S, M104V и M104I привели к снижению стабильности TvDAAO в различнойстепени. TvDAAO M104L по стабильности близка к ферменту дикого типа.
В то жевремя, объемные ароматические замены M104F, M104Y и M104W приводят кзаметной стабилизации фермента.T = 56 oC, [E]0 = 10 мкг/млwt-TvDAAOTvDAAO M104ATvDAAO M104STvDAAO M104VTvDAAO M104ITvDAAO M104LTvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104WОстаточная активность, A/Ao1,00,80,60,40,20,0020406080100120140160Время, минРис. 4.12.
Зависимости остаточной активности от времени мутантных TvDAAO с заменами M104A (♦,─), M104S (▲,─), M104V ( ,─), M104I (►,─), M104L (▼,─), M104F(▲,─), M104Y (●,─), M104W (♦,─) и TvDAAO дикого типа (■,─). Концентрацияферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температура инкубации 56°С.106В предыдущих работах нашей лаборатории было неоднократно показано, чтоTvDAAO дикого типа и ее различные мутантные формы при повышенныхтемпературах инактивируются в соответствии с диссоциативным механизмомтермоинактивации, который был подробно описан в работах О.М. Полторака длянекоторых других олигомерных белков [77,79,166,167].
Согласно этому механизмуна первой стадии происходит обратимая диссоциация активного димера нанеактивные мономеры, а на второй стадии субъединицы необратимо денатурируют(схема 1.1). Экспериментальные зависимости остаточной активности фермента отвремени корректно описываются суммой двух экспоненциальных функций искорость инактивации фермента зависит от его концентрации [56,57,76,168].В качестве примера на рис.
4.13 представлена типичная зависимостьостаточной активности от времени для мутантной TvDAAO M104F при 60°С.Данная зависимость аппроксимирована моноэкспоненциальной a×exp(b×x) ибиэкспоненциальной A×exp(-k1×x) + B×exp(-k2×x) функциями. Хорошо видно, чтоэкспериментальныеданныенемогутбытькорректноописаныпростойэкспоненциальной функцией и значительно лучше аппроксимируются суммой двухэкспонент.
Для подтверждения правомерности описания экспериментальныхданныхсуммойдвухэкспоненциальныхфункцийдлятермоинактивациимутантных форм TvDAAO была проверена достоверность аппроксимации моно- ибиэкспоненциальными моделями в соответствии с критерием Фишера [169].Дляоднопараметрическихфункцийвидаy=f(x),критерийФишерарассчитывается по формуле:адэкспгдеад –ср,дисперсия адекватности,ср– дисперсия среднего.Дисперсия адекватности вычисляется по формуле:∑адгдеэкспэкспрасч,– экспериментальные значения в i-ой точке,i-ой точке,– количество экспериментальных точек,107расч– расчетные значения в– число коэффициентов вуравнении. В случае аппроксимации моноэкспонентой m = 2, а в случаеаппроксимации биэкспонентой m=4.Для расчета дисперсии среднего использовали следующее выражение:эксп∑ср,сргдеср– среднее значение в i-ой точке.1,00,9BiExp (User)A*exp(-k1*x)+B*exp(-k2*x)ModelОстаточная активность, A/AoEquation0,83,28743E-4Reduced Chi-SqrAdj.
R-Square0,7A/Ao0,60,99537ValueStandard Error0,577260,043150,430470,047160,101570,011120,016390,00185ABk1k2Exp2PMod1Modely = a*exp(b*x)Equation0,00301Reduced Chi-Sqr0,95762Adj. R-Square0,50,4abA/AoValueStandard Error0,889750,02501-0,035540,001980,30,20,10,0020406080100120Время, минРис. 4.13. Зависимость остаточной активности от времени мутантной TvDAAO M104F.Концентрация фермента 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температураинкубации 60°С.Аппроксимацияэкспериментальныхданныхмоноэкспоненциальной (─) и биэкспоненциальной (─) функциями.Аппроксимацияявляетсяадекватной,есливычисленноезначениекоэффициента Фишера Fэксп меньше теоретического значения Fтеор.
В таблице 4.6,в качестве примера, представлены результаты расчета статистических параметровдля оценки адекватности аппроксимации зависимости остаточной активности отвремени для мутантной TvDAAO M104F при 60 °C. Теоретический коэффициентFтеор взят из таблицы распределения Фишера для доверительной вероятности,равной 0,95.108Таблица 4.6.Значения статистических параметров оценки адекватности моделей для мутантнойформы TvDAAO M104F при 60 °C.МодельПараметрy=A·exp-k·xy=A·exp-k1·x+B·exp-k2·x1,96·10-32,69·10-4ад1,49·10-4срэксп13,141,80теор2,022,05Из таблицы 4.6 видно, что в случае моноэкспоненциальной модели значениеэкспериментальноготеоретическоекоэффициентазначение.экспериментальногоДлякоэффициентаФишерапревышаетбиэкспоненциальнойФишерасоответствующеемоделиудовлетворяетзначениетребованиюадекватности модели, то есть предложенная аппроксимация экспериментальныхданных суммой двух экспоненциальных функций является корректной истатистически обоснованной.
Вышесказанное означает, что процесс температурнойинактивации мутантной TvDAAO M104F является сложным и протекает, покрайней мере, в две стадии.Для диссоциативной термоинактивации олигомерных ферментов характерныследующие признаки [79]:1. Наличие изломов (т.е. двух линейных участков) на зависимостяхостаточной активности от времени в полулогарифмических координатах.2.
При фиксированной температуре тангенс угла наклона первого линейногоучастка не зависит от концентрации фермента, а для второго линейного участкапроисходит увеличение тангенса угла наклона при уменьшении начальнойконцентрации фермента.В качестве примера на рис. 4.14 и рис. 4.15 представлены типичныезависимость остаточной активности от времени для мутантной TvDAAO M104F вполулогарифмических координатах при различных температурах (54-64°С) иначальных концентрациях фермента (3, 5, 10 и 20 мкг/мл). Действительно, данные109зависимости представляют собой прямые с изломом.
Кроме того, из рис. 4.15видно, что наклоны начальных линейных участков до точки излома совпадают, апосле точки излома наклон увеличивается с уменьшением начальной концентрациифермента. Такого рода зависимости были получены для всех мутантных формTvDAAO с заменами в 104м положении. Полученные нами данные позволяютсделать вывод о том, что термоинактивация мутантных TvDAAO при повышенныхтемпературах, как и для фермента дикого типа, протекает по диссоциативномумеханизму. Для всех мутантных форм двухстадийный характер термоинактивациинаблюдается во всех исследованных интервалах температур (которые зависят отстабильности мутантов) и при различных концентрациях ферментов.Исходя из вышесказанного, для наиболее корректной интерпретацииэкспериментальных данных, сравнения констант скорости термоинактивации,периодов полуинактивации, эффектов стабилизации и дестабилизации отдельныхточечных замен и т.д., зависимости остаточной активности от времени приразличных температурах для всех мутантов и фермента дикого типа былиполучены при одинаковой начальной концентрации ферментов, равной 10 мкг/мл.Используяматематическийаппараттеориидиссоциативнойтермоинактивации, который подробно изложен в [79,167], были рассчитаныконстанты скорости инактивации для обеих стадий процесса для всех мутантныхTvDAAO.
Результаты расчетов приведены в таблице 4.7 в сравнении саналогичными параметрами для TvDAAO дикого типа.110[E]0 = 10 мкг/мл (const)0ln(A/Ao)-1-2o54 Co56 Co58 Co60 Co62 Co64 C-3-4020406080100120140160Время, минРис. 4.14. Зависимости остаточной активности от времени мутантной TvDAAO M104F вполулогарифмическихкоординатахприразличныхтемпературах.Концентрация фермента 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температура 54°С (■,─),56°С (●,─), 58°С (▲,─), 60°С (▼,─), 62°С (♦,─) и 64°С (◄,─).oT = 58 C (const)0,0ln(A/Ao)-0,520 мкг/мл-1,0-1,5-2,010 мкг/мл3 мкг/мл-2,50204060805 мкг/мл100120140160Время, минРис. 4.15.
Зависимости остаточной активности от времени мутантной TvDAAO M104F вполулогарифмических координатах при различных начальных концентрацияхфермента. Температура 58°С, 0,1 М КФБ, рН 8,0, концентрации фермента –3 мкг/мл (◄,─), 5 мкг/мл (▼,─), 10 мкг/мл (▲,─) и 20 мкг/мл (■,─).111В случае мутаций M104A и M104S произошло смещение температурногодиапазона, в котором реализуется диссоциативный механизм, в сторону болеенизких температур на 2 °С по сравнению с ферментом дикого типа, причем мутантTvDAAO M104A является наименее стабильным среди мутантов, полученных вочищенном виде (рис.
4.12, табл. 4.7). При температуре 56°С, для которойприведены кинетические кривые на рис. 4.12, в результате замен M104A и M104Sконстанты скорости инактивации первой стадии увеличились в 3,6 и 2 раза, а длявторой стадии в 2,3 и 1,5 раза, соответственно (табл. 4.7). Для четырех заменM104V, M104I, M104L и M104W температурный диапазон остался прежним,однако значения констант скоростей термоинактивации изменились по сравнениюс ферментом дикого типа.
Для мутантных TvDAAO M104Y и TvDAAO M104Fданный диапазон сдвинулся в область более высоких температур на 2°С и 4°С,соответственно. Исходя из зависимостей остаточной активности от времени,представленных на рис. 4.12, были также рассчитаны периоды полуинактивациидля всех мутантных TvDAAO при всех изученных температурах (табл. 4.8).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
