Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 18
Текст из файла (страница 18)
4.5 и рис. 4.6).Результаты очистки и параметры образцов TvDAAO, которые были использованыдля изучения свойств, представлены в таблице 4.2.Далее для полученных очищенных мутантных TvDAAO и фермента дикоготипа были изучены свойства – субстратная специфичность и температурнаястабильность.4.1.3. Каталитические свойства мутантных TvDAAO с заменами в 104положенииДля получения профилей субстратной специфичности мутантных TvDAAO сзаменами в 104м положении и фермента дикого типа нами были определеныконстанты Михаэлиса (КМ) и каталитические константы (kcat) с различнымиD-аминокислотами для всех полученных ферментов. Для этого были изученызависимости активности ферментов от концентрации различных D-аминокислот.ПолученныезависимостипредставлялисобойклассическиекривыеМихаэлиса-Ментен. Типичный пример такой зависимости приведен на рис. 4.7 длямутантной TvDAAO M104F с D-метионином.
Полученные экспериментальныеданные аппроксимировали гиперболической функцией методом нелинейнойрегрессии с помощью программы Origin Pro 8.5. В результате получали значенияКМ и Vm. Используя значения Vm и концентрацию активного фермента (см.
пункты3.2.13, 3.2.14), рассчитывали значение kcat. Затем для каждого субстрата быларассчитана каталитическая эффективность фермента – отношение величины kcat кКМ. Значения kcat, КМ и kcat/KМ для мутантных TvDAAO и фермента дикого типаприведены в таблицах 4.3-4.5. Для наглядности, зеленым цветом и полужирнымшрифтом выделено улучшение соответствующих кинетических параметров посравнению с ферментом дикого типа.961,2Активность, Ед/мл1,00,8Hyperbly = P1*x/Equation(P2 + x)Reduced C 4,93894Adj. R-Squ 0,99647Model0,60,4activity, u/activity, u/Value Standard1,30 0,016144,27 0,15155P1P20,20,004812C(D-Met), мМ1620Рис. 4.7.
Типичная зависимость активности мутантной TvDAAO M104F от концентрациисубстрата (D-метионина). Концентрация фермента 10 мкг/мл. 50 мМ КФБ, рН8,0, 30 °С. Аппроксимация экспериментальных данных гиперболическойфункцией.Для наглядности на рис. 4.8-4.11 представлены относительные значенияконстант Михаэлиса (Кмmut/Кмwt·100%), относительные значения каталитическихконстант(kcatmut/kcatwt·100%),эффективностиотносительные((kcat/KМ)mut/(kcat/KМ)wt·100%)значенияикаталитическойабсолютныезначениякаталитической эффективности (kcat/KМ)mutдля мутантных TvDAAO и ферментадикого типа.
Улучшению Км соответствует ее уменьшение (меньше 100%), аположительному эффекту в случае kcat и kcat/KМ соответствует их увеличение(больше 100%).97Таблица 4.3.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами M104A, M104S, M104V и фермента дикого типа.Форма TvDAAOДикий типСубстратD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-LysKM, мМkcat, с-10,46±0,0316,7±0,714,4±1,20,78±0,0237±40,37±0,040,45±0,060,49±0,0422,6±1,511,1±0,829,3±3,481±1109±285±329,1±0,320,5±0,927,2±0,822,5±1,942,4±1,462±21,75±0,043,54±0,21M104Akcat/ KM,мМ-1с-11756,55,9370,567450872,80,160,12KM, мМkcat, с-11,42±0,0555±148±610,6±0,729,7±1,49,0±0,30,14±0,01* 20,1±0,31,78±0,0415,8±1,10,62±0,0651±20,62±0,0624,1±1,60,41±0,0232,6±0,634,8±0,910,0±0,7нет активности17,5±0,95,9±0,2M104Skcat/ KM,мМ-1с-1380,220,301420,118239803,5KM, мМkcat, с-11,47±0,0478±138±412,4±0,740±314,4±0,50,40±0,02 35,2±0,526,7±1,9 2,16±0,070,67±0,0452±10,49±0,10 27,2±3,60,30±0,03 32,0±1,439,9±0,716,7±0,7нет активностинет активности0,34M104Vkcat/ KM,мМ-1с-1530,320,36890,0878551062,4KM, мМkcat, с-11,99±0,1048±399±110,65±0,0346±80,73±0,050,58±0,100,78±0,0718,6±0,8101±320,3±0,845,8±3,953±22,59±0,2253±222,3±2,745,6±2,542,2±0,8нет активностинет активностиkcat/ KM,мМ-1с-1510,420,4682,60,067339582,3Таблица 4.4.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами M104I, M104L, M104E, M104K.Форма TvDAAOM104IСубстратKM, мМD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-Lyskcat, с-11,48±0,0378±136±415,0±0,880±645,0±2,00,48±0,02 38,0±0,737±31,87±0,050,49±0,03 34,9±0,60,60±0,05 20,8±1,30,48±0,03 29,8±0,836,0±0,914,6±0,9нет активности25,2±2,6 2,27±0,41M104Lkcat/ KM,мМ-1с-1530,420,57790,057235622,50,09KM, мМkcat, с-11,02±0,03118±280±5170±1035±1160±100,23±0,01 34,9±0,448±56,3±0,40,33±0,03 36,6±0,70,27±0,02 19,2±0,90,29±0,0350±345,1±0,915,5±0,7нет активностинет активностиM104Ekcat/ KM,мМ-1с-11162,14,51530,13112711702,9KM, мМkcat, с-10,60±0,0266±133,4±2,615,0±0,627,0±1,914,6±0,50,15±0,01 34,0±0,4н.д.**2,00±0,200,37±0,0265±10,47±0,06 31,7±2,40,34±0,0251±255,1±1,018,0±0,8нет активности88,3±22,163±1298M104Kkcat/ KM,мМ-1с-1KM, мМkcat, с-1kcat/ KM,мМ-1с-11110,450,54230н.д.179671493,062,28±0,1286±1291±90,67±0,0522,40,100,11310,71н.д.51±18,3±0,810,1±0,621,0±0,6нет активности55±240,7±10,531,5±1,329,5±1,7нет активности1,30±0,201,41±0,101,50±0,460,67±0,0531±43927,2470,95н.д.Таблица 4.5.Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами M104F, M104Y, M104W и TvDAAO Del_99-110.Форма TvDAAOM104FСубстратKM, мМD-MetD-AlaD-ValD-LeuD-SerD-PheD-TyrD-TrpD-AsnD-ThrD-Lyskcat, с-14,30±0,1580±127,7±1,2159±421,5±0,6105±21,37±0,06 22,1±0,338,2±1,364±11,05±0,05 14,2±0,32,26±0,818,5±5,80,78±0,06 15,5±0,568,4±5,873±5нет активностинет активностиM104Ykcat/ KM,мМ-1с-118,65,74,916,21,713,58,219,91,1KM, мМkcat, с-12,09±0,0757±140±419,5±1,060±625,2±1,41,02±0,05 22,7±0,524,3±1,129,4±0,50,86±0,04 24,2±0,41,69±0,418,6±2,60,44±0,03 17,1±0,419,7±0,35,7±0,3нет активностинет активностиM104Wkcat/ KM,мМ-1с-127,20,480,4222,31,2128,35,11393,4KM, мМkcat, с-13,18±0,0886±193±314,5±1,231±262±20,82±0,03 22,9±0,417,3±0,425,4±1,60,99±0,05 23,6±0,31,03±0,239,2±2,90,58±0,03 15,1±0,321,9±2,017,9±0,8нет активностинет активностиDel_99-110kcat/ KM,мМ-1с-127,16,42,028,10,6823,98,925,80,82KM, мМkcat, с-10,80±0,0645±718,8±2,40,14±0,0132,7±0,85,1±0,53,06±0,1610,8±0,2kcat/ KM,мМ-1с-1410,110,16801,35±0,110,44±0,062,1±0,337±846±217,2±1,615,1±1,023,4±2,634397,20,63н.д.6,5±1,0н.д.* - Зеленым фоном и полужирным шрифтом выделено случаи улучшения каталитических параметров мутантных TvDAAO по сравнению стаковыми для фермента дикого типа** - нет данных99Из таблиц 4.3-4.5 и рис.
4.8-4.11 следует, что введение различных замен в104е положение в области активного центра привело к получению мутантных формфермента с различным профилем субстратной специфичности. Все мутантныеферментынеактивнысD-Thr,активностьсD-LysсохранилитолькоTvDAAO M104A и M104I. В целом, мутантные TvDAAO c алифатическихзаменами M104A, M104S, M104V, M104I имеют весьма схожие профиликаталитической эффективности – для всех четырех ферментов наблюдаетсяснижение каталитической эффективности с небольшими субстратами (D-Ala,D-Val, D-Ser), что связано как с увеличением Км, так и со снижениемкаталитической активности с этими субстратами, в то время, как с объемнымиалифатическими и ароматическими субстратами каталитическая эффективностьэтих мутантов практически не изменилась или увеличилась (с D-Leu) по сравнениюс ферментом дикого типа.
По отдельным мутантам можно выделить следующиемоменты.TvDAAO M104Aимеетсущественноболеенизкуюкаталитическуюактивность c D-Ala, D-Val, D-Ser. Значения kcat для этих субстратов уменьшились всреднем в 10 раз. Наблюдается улучшение Км с D-Leu (в 5,5 раз), D-Ser (в 2,3 раза),D-Asn (в 2,3 раза) и D-Lys (в 1,7 раза). Каталитическая активность возросла с D-Pheи D-Lys почти в 2 раза в обоих случаях. Фермент неактивен с D-Thr, но активен сD-Lys.TvDAAO M104S обладает более высокой каталитической активностью сD-Phe (почти в 2 раза).
Также наблюдается небольшое улучшение в активности сD-Leu и D-Tyr. Так же, как и TvDAAO M104A, данный фермент имеет болеенизкую каталитическую активность c D-Ala, D-Val, D-Ser. Значения Кмулучшились с D-Leu (в 2 раза), D-Ser (в 1,4 раза), D-Trp (в 1,7 раза) и D-Asn (в 1,3раза). Фермент неактивен с D-Thr и D-Lys.TvDAAO M104V обладает наибольшей активностью с D-Leu ( увеличение в1,8 раза) среди всех полученных мутантов.
Фермент имеет повышеннуюактивность с D-Met (в 1,2 раза) и D-Phe (в 2 раза). Кроме того, немного улучшилисьзначения Км с D-Leu и D-Asn. С D-Thr и D-Lys фермент неактивен.100Рис. 4.8. Относительные значения констант Михаэлиса (КМ) для мутантных TvDAAO c заменами Met104 на Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe,Tyr, Trp. За 100% приняты значения КМ фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.101Рис. 4.9. Относительные значения каталитических констант (kcat) для мутантных TvDAAO c заменами Met104 на Ala, Ser, Val, Ile, Leu,Phe, Tyr, Trp. За 100% приняты значения kcat фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.102Рис. 4.10.
Относительные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO c заменами Met104 на Ala, Ser,Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp. За 100% принята каталитическая эффективность фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.103Рис. 4.11. Абсолютные значения каталитической эффективности (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO c заменами Met104 на Ala, Ser, Val,Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp.104TvDAAO M104I имеет повышенную активность с D-Leu (в 1,3 раза) и D-Phe(в 1,3 раза).
Фермент неактивен с D-Thr, но активен с D-Lys.TvDAAO M104L обладает наилучшей каталитической активностью средиполученных мутантов со многими субстратами, за исключением отсутствияактивности D-Thr и D-Lys. Значения kcat увеличились с D-Met (в 1,5 раза), D-Ala (в1,5 раза), D-Val (в 1,9 раза), D-Leu (в 1,2 раза), D-Phe (в 1,3 раза) и D-Trp (в 1,2раза). Однако стоит отметить, что произошло возрастание значений Км с D-Met (в2,2 раза), D-Ala (в 4,8 раза), D-Val (в 2,4 раза).TvDAAO M104F обладает повышенной каталитической активностью с D-Ala(в 1,5 раза), D-Val (в 1,2 раза) и D-Asn (в 1,2 раза). С D-Thr и D-Lys ферментнеактивен. Стоит отметить, что среди полученных мутантов этот фермент являетсянаиболее активным с D-Ser – значение Км не изменилось, а kcat увеличилась в 3 разапо сравнению с диким типом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
