Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Мутант в отличие отфермента дикого типа не проявляетактивности с D-лактатом.Ser335 играет важную роль впереносе протона от αNH3+-группысубстрата на растворитель в ходекатализа.В результате всех мутаций удалосьдостичь положительного эффектана каталитическую активностьфермента с D-Asp и при этомсохранить эффективный катализ стакими субстратами, как D-Ala и DArg. Это означает, чтоаминокислотные остатки, которыебыли мутированы, расположены вУвеличение значения kcat/Км с Dнекотором удалении от активногоAla, D-Asp и D-Arg в 3, 6 и 1,6 раза.центра, но влияют на структуру икатализ.Кинетические свойства, термостабильность и эффективность связыTrp243 играет важную роль ввания FAD изменилисьобразовании конформации белка,незначительно. Состояниетребуемой для эффективногоолигомеризации зависит отсвязывания FAD.
Помимо этого,концентрации мутанта.Trp243 стабилизирует димернуюформу фермента за счет Ван-дерKD(FAD) увеличилась в 19 раз.Ваальсовых и гидрофобныхСлабый межсубъединичныйвзаимодействий.контакт – мутант являетсямономером.Увеличение каталитическойэффективности всех мутантов вреакции с D-Asp в 2-5 раз.Величина kcat/Км по D-Ala и D-Argсоставляет 0,5-1,9 таковой дляфермента дикого типа.65Инженерия субстратнойспецифичности [55]M213GВлияние остатковактивного центра насубстратнуюспецифичность [149]Аминокислотныезамены остатковMet213Tyr223Tyr238Arg285Ser335Gln339Изучение влияниясшивания димерафермента на егостабильность иактивность [148]Объединение двухполипептидныхцепей DAAOсшивкой издипептида Tyr-ThrЗначительное увеличениекаталитической эффективности приокислении нафтил-производныхаминокислот.
В реакции сD-1-нафтилаланином величина kcatувеличилась в 7 раз, а Км снизиласьв 1,3 раза. Значение kcat/Км дляD-1-нафтилаланина в 180 раз выше,чем для D-Ala.Каталитическая активность всехмутантов с D-Ala, D-Arg ицефалоспорином С ниже, чем дляфермента дикого типа. Введениеположительно заряженныхостатков в любое из положенийобеспечило значительноеувеличение значения kcat/Км сD-Asp. Изменения спектральныххарактеристик для мутантов ненаблюдалось.Tm увеличилась на 5°С.Стабильность при инактивацииH2O2 увеличилась в 2 раза.Каталитическая эффективность срядом субстратов ухудшиласьвследствие повышения KM.66В активном центре RgDAAOостаток Met213 находится нарасстоянии 3,8Å от субстрата и,следовательно, участвует вориентации и связываниисубстрата.Все остатки принадлежатактивному центру молекулыRgDAAO и обеспечиваютоптимальную конформацию иподходящее микроокружение длясвязывания субстрата и катализа.Сшиванием димера RgDAAOможно добиться его температурнойи операционной стабилизации.G52VG52CG52TИзучение кислородногоканала в структуреRgDAAO [60,61].W50FW50PW50RT201LT201VI225FI225VЗаменыG52VпривелакОстатки, находящиеся вуменьшению активности с О2 в 100кислородном канале играютраз[61].
С помощью насыщающеговажную роль в транспорте О2 к Siмутагенеза изучены остатки Trp50,стороне FAD в активном центреThr201иIle225.Наиболеефермента. Направленный мутагенезреакционноспособным мутантом состатков в данном канале можетО2 является RgDAAO T201L (KMприводить к повышениюуменьшилась в 5 раз, активностькаталитической активностивыросла в 3 раза).фермента.67Цель мутагенезаАминокислотнаязаменаD206LD206GD206NИсследование роликонсервативного остаткаAsp206 в катализе исвязывании кофактора[156]D206ED206AD206SИзучение роликонсервативного His324 вкатализе [157]Повышениестабильности противинактивации пероксидомводорода [72]H324NH324QH324AH324YH324EH324RH324LH324KM104LM226LM245LM339LЭкспериментальный результатTvDAAOМутанты неактивны.
Утратилиспектры поглощения характерныедля FAD-содержащих белков.Спектр поглощения, идентичныйферменту дикого типа, мутантсохранил 90% исходнойактивности.Эффективность связывания FADзначительно ниже, чем дляфермента дикого типа.Каталитическая активность сD-Ala ниже в 3-16 раз.Ухудшение каталитическойэффективности в реакции с D-Alaв 3-11 раз.Мутанты неактивны. Отсутствуютпики спектра поглощения,характерные для FAD-содержащихбелков.Мутанты практически неактивны сD-Ala. Мутант M104L стабильнеедикого типа вротив инактивацииH2O2.68Таблица 2.4гВывод о роли исследуемогоостаткаAsp206 стабилизируетконформацию, оптимальную дляэффективного связывания FAD.Атомы кислорода карбоксильнойгруппы остатка участвуют вобразовании водородных связей сдругими аминокислотнымиостатками.
Следовательно, привведении замены D206E свойствамутанта незначительно отличаютсяот дикого типа.Остаток His324 фиксируетоптимальную для связывания FADконформацию.Остатки, расположенные наповерхности значительно сильнееподвержены окислению, чемостатки, находящиеся внутриM209LM156LИзучение субстратнойспецифичности(неупорядоченныймутагенез) [158]V167AP291SP309SA343DИзучение влияниясшивания димераTvDAAO на егостабильность иактивность [148]Объединение двухполипептидныхцепей TvDAAOсшивкой издипептида Lys-LeuСшивка TvDAAO сгемоглобином изVitreoscilla и экспрессияфьюжн-белка в клеткахE.coli[159]Полипептиднаяцепь гемоглобинапришита к N-концуTvDAAOПовышениетемпературнойстабильности иинженерия субстратнойспецифичности [76]C108AC108SПовышена стабильность вприсутствии H2O2.
Каталитическаяэффективность с D-Ala для M156Lв 2 раза выше, чем для ферментадикого типа.Мутантные ферменты полностьюпотеряли активность. В спектре ихпоглощения отсутствует пик,обусловленный поглощениемFAD.TM увеличилась на 2°С.Стабильность при инактивацииH2O2 увеличилась в 1,5 раза.Каталитическая активность сбольшинством D-аминокислотблизка к дикомутипу, нокаталитическая эффективностьнесколько ухудшилась из-заповышения значений KM.Получена конструкция VHbTvDAAO, состоящая изгемоглобином из Vitreoscilla (VHb)и TvDAAO.
Выход фьюжн-белка врезультате экспрессии в клеткахE.coli был в 2 раза выше, чем дляфермента дикого типа.Увеличена каталитическаяэффективность фермента поотношению к D-аминокислотам сбольшим гидрофобным радикаломв боковой цепи.Ухудшение кинетических свойстви температурной стабильности.69белковой глобулы. ОстаткиMet104, Met156 и Met209расположены близко кповерхности фермента.Остатки играют важнуюструктурную роль. Ониподдерживают конформациюфермента, требуемую дляэффективного катализа.Сшиванием димера TvDAAOможно добиться повышения еготемпературной и операционнойстабильности.VHb-TvDAAO может обладатьповышенной стабильностью икаталитической активностью засчет увеличения локальнойконцентрации O2.Остаток Cys108 оказываетсущественное влияние натемпературную стабильностьфермента.C108АИзучение роли остатковArg169 и Arg220 вмежсубъединичномконтакте TvDAAO [51]Изучение роли остаткаCys108 в катализе [160]R169AR220AR220EC108DC108SУвеличена каталитическаяэффективность фермента поотношению к D-аминокислотам сбольшим гидрофобным радикаломв боковой цепи.
Введениеаминокислотной замены C108Fприводит к повышениютемпературной стабильностифермента в 2,2 раза икомпактизации белковой глобулы.Все полученные мутантныеTvDAAO экспрессировались вактивной и нерастворимойформах, а по термостабильностизначительно уступали ферментудикого типа.Введение обеих замен привело кконформационным измененияммолекулы белка. Притермоинактивации мутантныхформ наблюдается необратимаядиссоциация FAD из активногоцентра. Кинетические свойствамутантных форм C108S и C108D вреакции с D-Ala ухудшились в 2 и3 раза соответственно.70Остатки Arg169 и Arg220 играютважную роль в поддержаниистабильного димерного состоянияTvDAAO.Остаток Cys108 участвует врегуляции активного центрафермента и поддержании егостабильности.A single Phe54Tyrsubstitution improves thecatalytic activity andthermostability ofTrigonopsis variabilis Damino acid oxidase [161]F54AF54SF54YИнженерия субстратнойспецифичности,повышение активности собъемными субстратами[57]F54AF54SF54YИнженерия субстратнойспецифичности[56]F258AF258SF258YВсе полученные мутанты обладалиувеличенной активностью с CPC иповышенной температурнойстабильностью по сравнению сферментом дикого типа.Мутант с заменой F54Aинактивировался в ходе выделенияи очистки.
В результате заменыF54S была повышенакаталитическая активность сПолученные данныеобъемными D-аминокилсотамисвидетельтвует о важной ролиD-Trp, D-Tyr, D-Phe, D-Leu. Востатков на входе в активныйрезультате замен F54S и F54Yцентр фермента в стерическомповышена каталитическаяконтроле и связывании субстратов.активность с CPC и наблюдалосьнебольшое повышениетермостабильности.Замена F258Y привела кпонижению активности сбольшинством субстратов, заменыF258A и F258S вызвали резкоесужение профиля субстратнойспецифичности фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
