Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 11
Текст из файла (страница 11)
С помощьюзамен на остатки серина и тирозина была исследована роль остатка Tyr238.53Оказалось, что этот остаток оказывает слабое влияние на связывание субстратов вактивном центре, но конформационные изменения боковой цепи при его заменемогут играть важную роль в катализе [152,153]. При введении в структуруRgDAAO замены S335G фермент потерял активность с D-лактатом. Этот факт даетоснования предполагать, что остаток Ser335 играет важную роль в переносепротона от αNH3+-группы субстрата на растворитель в ходе катализа [154]. ЗаменаW243Y практически не изменяет кинетические свойства, термостабильность иэффективность связывания FAD, тогда как введение мутации W243I вызываетувеличение KD(FAD) в 19 раз и ослабляет межсубъединичное взаимодействие вдимере RgDAAO.
Это означает, что Trp243 играет важную роль в образованииконформации белка, требуемой для эффективного связывания FAD. Помимо этого,остаток Trp243 стабилизирует димерную форму RgDAAO за счет Ван-дерВаальсовых и гидрофобных взаимодействий [155].Интересной работой является удаление петли Pro302-Glu322 (и ее частиLys307-Ser311) в структуре RgDAAO [48,49]. Оказалось, что эта петляобеспечивает прочный контакт между субъединицами. Снижение прочностидимерного контакта не влияет на кинетические свойства RgDAAO, однакооказывает значительное отрицательное действие на стабильность под действиемденатурантовипротеолитическихагентов.Невысокаяпротеолитическаястабильность мутанта с удаленными Lys307-Ser311 обусловлена тем, что частьпетлиSer311-Lys321экспонированавраствориподверженадействиюпротеолитических ферментов. Методом неупорядоченного мутагенеза был полученряд мутантов RgDAAO, обладающих каталитической активностью с D-Asp и приэтом по-прежнему проявляющих высокую активность с такими субстратами, какD-Ala и D-Arg.
[105].Одной из последних и весьма ярких работ, связанных с белковойинженерией RgDAAO, является изучение канала, по которому O2 поступает вактивный центр DAAO к Si-стороне FAD [60,61]. Внутри кислородного канала спомощью компьютерного моделирования и методов молекулярной динамики былиопределены траектории движения кислорода, а также два высокоафинных сайта А54и B. Аминокислотные остатки, формирующие эти сайты, были изучены с помощьюнаправленного мутагенеза. Остаток Gly52 был заменен на остатки Cys, Val и Thr.Часть сайта А была заполнена боковой группой Val за счет введения замены G52V.Активность с кислородом для этого мутанта снизилась в 100 раз [61]. Кроме того,авторы выявили цепочку из трех молекул H2O, по которой может передаваться H+от иминокислоты на молекулу O2 во время ее восстановления до H2O2. В работе[60] была подробно исследована роль остатков Trp50, Thr201 и Ile225. В данныхположениях был выполнен насыщающий мутагенез и отобраны наиболеереакционноспособные мутанты при низкой концентрации кислорода.
Средиотобранных мутантов с заменами W50F, W50P, W50R, T201L, T201V, I225F, I225Vнаиболее интересной была мутантная форма RgDAAO T201L, которая обладала в 5раз более низким значением KM и в 3 раза более высокой константой скоростивосстановления O2, чем фермент дикого типа. Данная особенность делает этотфермент привлекательным для практического применения.2.4.4. Белковая инженерия DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO)Для TvDAAO опубликовано небольшое количество работ по белковойинженерии.
Это в первую очередь связано с тем, что трехмерная структура этогофермента долгое время оставалась неизвестна (см. пункт 2.1.3). Таким образом,внимание исследователей сместилось в сторону RgDAAO, с тех пор как в 2000 этотфермент был закристаллизован и была решена его структура, посколькуразнообразие подходов белковой инженерии могут позволить значительноулучшитьсвойстваприродногофермента.ОднакоTvDAAOзначительностабильнее других известных DAAO и не уступает им по каталитическихсвойствах, что делает весьма перспективным данный фермент в качествеотправной точки для направленного мутагенеза.
До установления трехмернойструктуры TvDAAO, вышло около 8 работ по белковой инженерии этого фермента,начиная с 1998 года, часть из которых опиралась на модельные структурыTvDAAO. Первые четыре работы были опубликованы группой авторов из Тайваняв период с 1998 по 2000 год. Первая статья посвящалась изучению роли55консервативного остатка Asp206 в структуре TvDAAO [156].
По аминокислотномувыравниванию, авторы предположили, что роль этого остатка может бытьаналогична роли остатка Asp192 в pkDAAO, который взаимодействует с Agr286 иTyr309, поддерживая правильную конформацию белковой глобулы для связыванияFAD. Было выполнено шесть аминокислотных замен остатка Asp206. Мутанты сзаменами D206L, D206G, D206N не проявляли каталитической активности, а такжеутратили спектр поглощения, характерный FAD-содержащим белкам. МутантыD206E, D206A, D206S сохранили от 6 до 90% исходной активности и имелиспектры поглощения, близкие к ферменту дикого типа.
Авторы предположили, чтоданный остаток может играть важную роль в связывании кофактора FAD. Годомпозже была опубликована работа, в которой изучалась роль консервативногоостатка His324 [157]. Положение для мутагенеза было выбрано аналогично изсравнения нескольких последовательностей DAAO и анализа структуры pkDAAO.В работе было получено 8 мутантных ферментов в 324 положении. МутантныеTvDAAO H324R, H324L, H324K совершенно потеряли активность и характерныйспектр поглощения для FAD-содержащих белков.
У остальные мутантныхTvDAAO с заменами His324N, H324Q, H324A, H324Y, H324E произошлоуменьшение каталитической активности в 1,5-4 раза и увеличение значений KM в1,4-2,5 раза с D-Ala. В результате было показано, что His324 играет важнуюструктурную роль и принимает участие в связывании FAD апоферментом. Вследующей работе была проведена замена остатков Met в TvDAAO с цельюповышения стабильности фермента против инактивации пероксидом водорода [72].Было заменено шесть остатков Met на остатки Leu. Четыре мутантные TvDAAOM104L, M226L, M245L и M339L практически полностью утратили каталитическуюактивность с D-Ala.
Стоит отметить, что эти остатки Met располагаются внутрибелковой глобулы. Замены двух других остатков M156L и M209L привели кувеличению каталитической активности в 1,2 и 2 раза соответственно. Мутанты сзаменами M104L, M156L и M209L были стабильнее фермента дикого типа приинактивации пероксидом водорода. Остатки Met104 и Met156 располагаются наповерхности белковой глобулы и доступны растворителю.
Таким образом, замена56остатков, подверженных окислению, перспективна для повышения операционнойстабильности TvDAAO, поскольку пероксид водорода является одним изпродуктов реакции, катализируемой этим ферментом. В заключительной своейработе исследователи охарактеризовали мутанты TvDAAO с заменами V167A,P291S, P309S и A343D, которые были получены с помощью ПЦР с ошибками[158]. Все мутанты были практически неактивны и не обладали спектромпоглощения FAD-содержащих белков.
Авторы предположили, что упомянутыеостатки играют важную структурную роль в TvDAAO.Начиная с 2000 года, настал перерыв в работах по белковой инженерииTvDAAO, что, по-видимому, было вызвано их нецелесообразностью и сложностьюинтерпретации результатов в отсутствии трехмерной структуры этого фермента.
В2008 году было проведено ковалентное сшивание двух субъединиц TvDAAO спомощью дипептида Lys-Leu, что позволило добиться небольшого повышениятемпературной стабильности (Tm увеличилась на 2°С) и стабильности противинактивации пероксидом водорода [148]. Ковалентная сшивание практически неповлияло на каталитическую активность с большинством D-аминокислот. В то жевремя вышла работа, в которой был получен химерный белок VHb-TvDAAO спомощью ковалентной пришивки гемоглобина из Vitreoscilla к N-концу TvDAAO[159].Ранее в 2005 году в работе [73] было показано, что окисление остатка Cys108в TvDAAO приводит к значительной потере активности фермента.
В нашейлаборатории была исследована роль этого остатка Cys108 с помощью замен наостатки Ala, Ser и Phe [76]. Полученные мутанты обладали различным профилемсубстратной специфичности, но важной особенностью являлось отсутствиеактивности с D-Ala, что может быть использовано в определении D-Ser вприсутствии D-Ala. Кроме того TvDAAO C108A и C108F обладали более высокойкаталитической эффективностью с цефалоспорином С, а TvDAAO C108F обладалаболее высокой термостабильностью, чем фермент дикого типа. Важнымдостижением являлась кристаллизация TvDAAO C108F, после чего впервые в миребыла решена ее пространственная структура с разрешением 2,8 и 1,8Å. Научной57группой из Австрии (г. Грац) в 2010 году было также проведено изучение ролиостатка Cys108 и его замена на остатки Ser и Asp в следствии структурногосходства[160].Авторысообщили,чтокинетическиепараметрыитермостабильность полученных мутантов в целом ухудшились по сравнению сферментом дикого типа.После установления трехмерной структуры TvDAAO нами были начатысистематические исследования взаимосвязи структуры и функции TvDAAO спомощью метода рационального дизайна.
В нашей работе [51] на основаниианализа структуры TvDAAO было показано, что димерная форма поддерживаетсяза счет образования 12 водородных связей аминокислотными остатками из разныхсубъединиц, причем Arg169 и Arg220 образуют по две водородные связи каждый,т.е. эти остатки отвечают за образование 8 из 12 водородных связей между двумясубъединицами. Роль остатков Arg169 и Arg220 в образовании межсубъединичныхконтактов в димере TvDAAO была изучена за счет введения замены R169A, R220A(для удаления водородных связей) и R220E (для создания отталкивания с Glu32другой субъединицы). Все полученные мутантные TvDAAO экспрессировались вактивной и нерастворимой формах, а по термостабильности значительно уступалиферменту дикого типа. Полученные данные подтвердили важную роль остатковArg169 и Arg220 в поддержании четвертичной структуры TvDAAO.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
