Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Например, при концентрации 400 мкг/млTvDAAO существует в виде тетрамеров, которые обладают более низкойактивностью в пересчете на одну субъединицу, чем димеры, на что указываетнелинейные характер зависимости активности от концентрации TvDAAO. Такимобразом, в начальный момент времени происходит диссоциация олигомеров иувеличение концентрации димеров, что и приводит к повышению активностиTvDAAO.342.3. Применение DAAO в биотехнологииВозможность применения DAAO в различных областях биотехнологии иорганического синтеза дало мощный толчок к поиску, клонированию и изучениюновых ферментом начиная с 1970-80 гг.
С точки зрения биотехнологическогоприменения наиболее перспективными оказались RgDAAO и TvDAAO. В первуюочередь это было обусловлено изначально высокой активностью природныхферментов с природным антибиотиком цефалоспорином C. Кроме того, как былоотмечено выше, TvDAAO на данный момент является наиболее стабильнымферментом среди изученных DAAO.2.3.1. Аналитическая биотехнологияКачественноеиколичественноеопределениеD-аминокислотвбиологических образцах имеет большое значение для медицины, химической ипищевойпромышленности.Например,D-аминокислотывходятвсоставпептидогликана клеточной стенки бактерий, их присутствие в пище можетговорить о ее бактериальном заражении [80]. Также в ходе производства ихранения пищевых продуктов, природные L-аминокислоты могут превращаться вD-изомеры.
В продуктах питания, как правило, содержатся такие D-аминокислоты,как D-Ala, D-Ser, D-Leu, D-Phe, D-Pro, D-Glu, D-Asp, D-Lys и D-Arg.D-аминокислоты содержатся в хлебе, кофе, овощах и фруктах, шоколаде, вине,молочных продуктах. Например, твердые сыры сортов Grana Padano и ParmigianoReggiano можно отличить друг от друга по содержанию D-Ala, D-Glu и D-Asp [26].Концентрация D-аминокислот может служить для оценки питательной ценностипищи, поскольку степень рацемизации аминокислот зависит от качества и способаполучения продуктов [81]. Таким образом, в пищевой биотехнологии DAAO можетбыть использована для контроля качества продуктов питания с помощьюколичественного определения как D-аминокислот, так и отношения изомеровD/(D+L) с использованием LAAO.Количественное определение D,L-аминокислот в биологических образцахиспользуется в клинической практике с тех пор, как была установлена связь между35некоторыми заболеваниями и нарушением метаболизма аминокислот.
Например,содержание D-Ala в сером и белом веществах мозга у пациентов с установленнымдиагнозом болезни Альцгеймера в 4 раза выше, чем в соответствующих участкахмозга здоровых людей [82]. Используя биосенсоры, можно отслеживать уровеньD-Ala и других аминокислот в больном и здоровом организме [83,84].Несмотря на то, что традиционные аналитические способы количественногоопределенияD-аминокислотхроматография,капиллярныйили(газоваяэлектрофорезобращено-фазоваяит.д.)жидкостнаяявляютсянадежными,воспроизводимыми и чувствительными методами анализа, они также являютсявремя-затратными, трудоемкими и дорогими, в следствии чего не подходят длядетекции в режиме реального времени [85].
Для этих целей в начале 1990-х годовбыло разработано несколько биосенсоров, основанных на DAAO [86]. Как правило,такие сенсоры содержат второй фермент, например, пероксидазу хрена, чтопозволяет проводить детектирование продукта сопряженной ферментативнойреакции. В начале 2000-х появились биосенсоры, содержащие pkDAAO и LAAO,служащие для определения соотношения D-аминокислот/L-аминокислот [87].Позже стали появляться амперометрические биосенсоры на основе DAAO дляопределенияклиническизначимыхвеществ,такихкакD-тироксиниD-пипеколиновая кислота (маркер цирроза печени и хронической печеночнойэнцефалопатии) [88]. Кроме того, биосенсоры на основе DAAO можноиспользовать и для анализа оптической чистоты медицинских препаратов,например, D,L-картинина и D,L-метотрексата [89,90].
Еще одним примером можетслужить определение R-периндоприла, также известного как «Коверзил». Этовеществоявляетсяингибиторомангиотензин-превращающегоферментадлительного действия и в основном используется при лечении гипертонии исердечной недостаточности. Для определения этого вещества на основе DAAO былсозданамперометрическийбиосенсор,имеющийпределобнаруженияR-периндоприла ~ 10 нМ [91].Биосенсоры, созданные на основе коммерчески доступной pkDAAO, какправило, имеют низкую стабильность [92], невысокую каталититическую36активность, полное отсутствие реакции с такими D-аминокислотами, как D-Asp иD-Glu.
Как следствие, такие биосенсоры показывают плохое воспроизведение идостаточно высокий предел обнаружения (10-4-10-5 М) и, таким образом, неподходят для определения, например, уровня D-Ser у человека, поскольку егоконцентрация составляет <10-6 М. Первые два недостатка были устранены прииспользовании дрожжевых RgDAAO [93]. Несколько позже остальных DAAO, дляопределения общих количеств D-аминокислот была использована TvDAAO.
На ееоснове был сконструирован кислород-независимый электрод с использованием2,6-дихлороиндофенола в качестве искусственного акцептора электронов [94]. Врезультате дрожжевые DAAO успешно заменили pkDAAO в биосенсорах. Этомутакже способствовало создание высокоэффективных систем экспрессии данныхферментов как в клетках E.coli [95–97], так и в клетках Pichia pastoris [58],Schizosaccharomyces pombe [98] и др. В результате первый биосенсор дляопределения D-Ser в тканях был создан в 2008 году [99].
В настоящее времяудалось добиться улучшения многих характеристик биосенсоров на основе DAAO(например, существенное уменьшение времени ответа) для их успешногоприменения при определении концентрации D-Ser в тканях [26,100,101]. Крометого, в последнее время создаются все больше биосенсоров на основе DAAO дляразличных целей. В 2013 году были сконструированы биосенсоры для определенияочень низких концентраций D-аминокислот в физиологических жидкостяхчеловека [102], а также амперометрический биосенсор, который успешноиспользовали для измерения содержания D-аминокислот во фруктовых соках [103].Стоит отметить, что для создания биосенсоров свойства природных ферментовмогут быть оптимизированы с помощью белковой инженерии (см. главу 2.4)[58,104].
Например, была получена мутантная RgDAAO M213R, которая обладалаактивностью с D-Glu и D-Asp (см. пункт 2.4.3). Однако ее активность снейтральнымиаминокислотамисильноуменьшилась,асположительнозаряженными субстратами пропала вовсе [54]. Этот мутантный фермент былиспользован для количественного определения нейтральных и отрицательнозаряженных D-аминокислот в сыре «Пармезан» и розовом вине. Однако ни37RgDAAO, ни RgDAAO M213R не подходят для определения общей концентрацииD-аминокислот. Для этих целей методом направленной эволюцией были полученыдве мутантные RgDAAO K118H и RgDAAO T60A/Q144R/K152E, обладающиевысокой активностью со всеми D-аминокислотами [105].Стоит упомянуть, что для применения в аналитических целях былопредложено использование апоформы DAAO [3].
Апоформа DAAO может бытьиспользована для определения количества различных гидролитических ферментов,например, щелочной фосфатазы. Основа метода заключается в том, что некоторыетакие ферменты могут гидролизовать искусственные субстраты (простетогены) собразованиемпростетическихгруппдругихферментов.Такимобразом,образующийся кофактор связывается с апоферментом и возникает ферментативнаяактивность, которую можно зафиксировать.
Например, щелочная фосфатаза можетгидролизовать флавинадениндинуклеотид фосфат (FADP) с образованием FAD, всвою очередь FAD связывается с апоформой DAAO с образованием холофермента,в результате чего с D-аминокислотами появляется активность DAAO, которуюможно зафиксировать с помощью сопряженной реакции пероксидазы хрена сABTS. Также можно использовать апоферменты глюкозоксидазы, оксидазыL-аминокислот, ксантиноксидазы и т.д., но апо-TvDAAO лучше всего подходит длятаких целей из-за достаточно высокой стабильности.
Стоит отметить, чтопростетоген FADP практически не проявляет активности как кофактор, чтоисключает возникновение фонового сигнала при проведении анализа, и не мешаетобразованию холофермента из FAD и апофермента. Описанный подход можетприменяться в иммуноферментном анализе, например, при использованииконъюгатовщелочнаяфосфатаза–стриптовидин.Такжебылопредложеноопределение одноцепочечных молекул ДНК [3].2.3.2. Тонкий органический синтезДрожжевыеDAAOиспользуетсявсинтезеα-кетокислотизсоответствующих D-аминокислот и получении природных и неприродных Lаминокислот из соответствующих рацемических смесей [3,4].
Неприродные38иL-аминокислотыα-кетокислотыширокоиспользуютсявкачествепредшественников при получении разнообразных лекарственных препаратов[106,107]. L-аминокислоты также применяются в качестве пищевых добавок икомпонентов инфузионных растворов [55]. DAAO в комбинации с каталазой и ωтрансаминазойприменяетсядляполученияоптическичистогоL-Alaизрацемической смеси. L-аланин является ключевым хиральным интермедиатом приполучениитакихлекарствкакбриварацетамилеветирацетам(противоэпилептические средства) [108]. Для данных целей широко используютсядрожжевые TvDAAO и RgDAAO [3,4,58].
Также описана четырехферментнаясистемаизApDAAO,каталазы,L-фенилаланиндегидрогеназы,формиатдегидрогеназы для полной конверсии рацемической смеси D,L-метионина в Lизомер[109].Неприродныенафтил-аминокислотыявляютсяисходнымивеществами для получения различных лекарственных препаратов [55]. Например,L-2-нафтилаланинвходитвсоставлекарственногопептидаНафарелина(Nafarelin™) [110]. Был разработан метод синтеза L-2-нафтилаланина, в которомиспользуется трехферментная система из RgDAAO, L-аспартатаминотранферазы икаталазы для полной конверсии рацемической смеси D,L-2-нафтилаланина вL-изомер с выходом до 98% и оптической чистотой порядка 99,5% [111]. Другимважнымсоединением,получаемымприучастииDAAO,является4-метилтио-2-оксомасляная кислота (МТОМК).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
