Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Данный феномен был ранее изучен в нашейлаборатории для рекомбинантной TvDAAO дикого типа.Отдельно стоит упомянуть о механизме действия DAAO. Аминокислотныхостатки, которые формируют активный центр DAAO, играют важную роль всвязываниииправильномориентированиисубстратаотносительноизоаллоксазинового цикла FAD, но не принимают непосредственного участиякатализе [2]. Процесс катализа ферментом протекает в несколько этапов. Напервом этапе происходит связывание D-аминокислоты в активном центрефермента и оптимальное ориентирование аминогруппы относительно N(5)-атомаFAD.
Непосредственно акт катализа протекает по гидридному механизму, врезультатечегопроисходитпереносгидрид-иона(Н–)наN(5)-атомизоаллоксазинового цикла FAD и образуется восстановленная форма кофактораFADH2 [32]. О прямом переносе гидрид-иона свидетельствуют также результатыизучения рН-зависимости первичного дейтериевого кинетического эффекта иизотопного эффекта растворителя в реакции окисления D-Ala и D-Asn,катализируемой RgDAAO [53].
Весь процесс катализа с большинством субстратов,как правило, протекает по упорядоченному механизму, в случае которого сначалапроисходит окисление FADH2 под действием кислорода, с последующейдиссоциацией иминокислоты (продукт окисления D-аминокислоты) из активногоцентра DAAO [2]. Скорость реакции при этом лимитируется отщеплениемиминокислоты от фермента. В пользу описанного механизма говорят данные,полученные при анализе трехмерных структур pkDAAO, RgDAAO и TvDAAO ввысоком разрешении. На рис.
2.4 представлен активный центр TvDAAO с “Re”стороны изоаллоксазиного цикла FAD. При связывании субстрата в активномцентре TvDAAO, карбонильная группа D-аминокислоты образует солевой мостик сArg302 (у RgDAAO Arg285) и водородную связь с окси-группой остатка Tyr243 (уRgDAAO Tyr223 и Tyr238), α-NH2 группа образует водородные связи с Gly330 (уRgDAAO Ser335) и через молекулу воды с Asn50 и Gln334 (у RgDAAO Asn54 иGln339). У RgDAAO боковой радикал субстрата попадает в гидрофобный карман,объем которого ограничен размером Met213, что играет определяющую роль в23субстратной специфичности этого фермента [54,55].
В структуре TvDAAO всоответствующем положении находится остаток Ser228. Однако в связываниибокового радикала субстрата в первую очередь участвуют остатки Phe54 и Phe258,которые играют важную роль в каталитических свойствах TvDAAO [56,57].Описанное расположение аминокислотных остатков в активном центре DAAOопределяет ее абсолютную стереоспецифичность к D-аминокислотам. Стоитотметить, что активный центр оксидазы L-аминокислот (LAAO) являетсяпрактически зеркальным отображением активного центра DAAO.
В результатеLAAO обладает абсолютной специфичностью к L-аминокислотам [58,59].Рис. 2.4. Расположение аминокислотных остатков в активном центре TvDAAO.В подтверждение того, что что ферментативная реакция, катализируемаяDAAO протекает по упорядоченному механизму, говорят также исследования,проведенные группой ученых из Италии. На примере RgDAAO ими был изученкислородный канал, который располагается на “Si” стороне изоаллоксазиногоцикла FAD.
По данному каналу кислород поступает из растворителя в активныйцентр фермента (рис. 2.5) [60,61]. С помощью компьютерного моделирования были24обнаружены два сайта - А и В, которые расположены внутри кислородного канала.Сайт А находится в непосредственной близости от FAD (3.5 Å от С4 атома) иучаствует в подведении кислорода к изоаллоксазиновому циклу FAD (рис.
2.5). Егофункция была исследована методом направленного мутагенеза. В результатевведения мутации G52V в структуру RgDAAO часть области сайта А оказаласьзаполнена боковой группой Val. Активность с кислородом для этого мутантаснизилась в 100 раз. Авторы предполагают, что роль сайта В, который находится в5 Å от диметилбензольного кольца FAD, заключается в локальном накоплениикислорода. Также была исследована роль остатков Trp50, Thr201 и Ile225 втранспортекислорода[60].МутантнаяформаRgDAAO T201Lобладалаувеличенной активностью и более низкими значениями KM с кислородом.Подобные кислородные каналы также обнаружены при анализе структур pkDAAO,hDAAO и TvDAAO.АБРис. 2.5.
А – канал, расположенный на Si-стороне FAD, по которому кислород поступает вактивный центр RgDAAO, IA-иминокислота, синими шариками показаны молекулыводы, наполняющие кислородный канал, Б - положение важных аминокислотныхостатков относительно высокоаффинных сайтов “A” и “B” [60,61].252.2. Основные свойства DAAO из различных источниковПостоянный рост числа аннотированных последовательностей DAAO содной стороны является следствием полногеномного секвенирования различныхорганизмов, а с другой стороны объясняется поиском новых ферментов для целейбиотехнологии.
Перспективным является поиск и клонирование генов daao изтермофильных микроорганизмов, однако работы в этом направлении пока неувенчались успехом.Таблица 2.2.Сравнение основных свойств DAAO из различных источников.ПараметрЧисло аминокислот в субъединицеpkDAAOhDAAO34734736835639,639,540,039,37,0, 7,2-RgDAAO TvDAAOМолекулярная масса субъединицы,кДаИзоэлектрическая точка, pI7,2, 7,4,5,17,8Максимум поглощения, нм274, 380,278, 372,274, 368,272, 360,455454455455378, 400,274, 370,485400, 490355, 415354350-350, 530354, 527355, 530355, 530Отношение поглощения A274/A4559,510,68,28,4pKa FAD (N(3)-H)9,410,310,610,12,2·10-78·10-62·10-81,5·10-70,0020,0070,2518,8окисленное состояниепереходное состояниевосстановленное состояние--Максимум флуоресценции(окисленное состояние), нмКонстанта диссоциации FAD (Kd), MКонстанта диссоциации бензоата,мM26В настоящее время наиболее перспективным направлением исследованийявляется изменение свойств известных DAAO с помощью белковой инженерии дляцелей биотехнологии [58].
На данный момент частично охарактеризованыферменты из ряда источников, однако наиболее полно изучены свойства pkDAAO,hDAAO, RgDAAO и TvDAAO, которые описаны в работе [2]. В таблице 2.2представленыобщиесвойстваэтихчетырехферментов[2,6,11,36,62–64].Некоторые общие характеристики свойственны всем DAAO, независимо отисточника, из которого выделен фермент. Например, каждая субъединица DAAOсодержит одну нековалентно связанную молекулу FAD в активном центре(рис. 2.3), что определяет характерный спектр поглощения, присущий всемфлавопротеинам, с двумя максимумами в видимой области при 360-380 и 455 нм(поглощает FAD) и одним большим максимумом в ультрафиолетовой области при272-274 нм (поглащает белок и FAD) (табл. 2.2).
Окисленная форма FAD являетсяфлуорофором с максимумом испускания на 530 нм.2.2.1. Каталитические свойстваВ настоящее время спектры субстратной специфичности изучены частичноили полностью для DAAO из С.boidini (CbDAAO) [65], Carp hepatopancreas [66],V.luteoalbum[67], F.oxysporum, C.parapsilosis [67], A.protophormiae [68] и др. ДляpkDAAO, hDAAO, RgDAAO и TvDAAO каталитические свойства подробноизучены различными авторами [11,66,67,69]. В таблице 2.3 суммированы данныепо каталитической активности для pkDAAO, hDAAO, RgDAAO и TvDAAO.
ДляTvDAAO представлено три столбца данных, в первом указаны значенияотносительной активности, полученные спектрофотометрически с использованиемпероксидазы из корней хрена и ее субстрата – о-дианизидина [67], во втором – приэлектрохимическойрегистрациипотреблениякислорода[69].Свойстварекомбинантной TvDAAO были также детально изучены в нашей лаборатории[51,56,57], и полученные нами данные представлены в последнем столбце втаблице 2.3. Для определения активности нами была использована наиболеераспространенная методика, основанная на использовании пероксидазы из корней27хрена и ее субстрата ABTS (см. пункт 3.2.14 раздела “Материалы и методы”).Стоит отметить, что результаты, полученные различными авторами для одного итого же фермента, могут отличаются между собой из-за использования различныхусловий при определении активности (pH, температура, буфер), а также вследствиеразличной концентрации растворённого кислорода, максимальная величинакоторой при нормальном давлении, 25ºС и рН 8,0 составляет 0,25 мМ, в то времякак значение КМ по кислороду для TvDAAO равно 0,8 мМ [2].
В целом можноотметить, что DAAO из микроорганизмов проявляют высокую активность снезаряженными и гидрофобными субстратами, например, с D-Ala, D-Val, D-Met иD-Trp, что, по-видимому, связано с использованием этих аминокислот к качествеодного из основных источников углерода, азота и энергии различнымимикроорганизмами [67]. Для DAAO из млекопитающих стоит отметить высокуюактивность с D-Pro, а также некоторую активность с D-Ala и D-Ser, играющихважную физиологическую роль.Описанные отличия в субстратной специфичности DAAO из различныхорганизмов могут быть объяснены тем, что в первичной структуре DAAO ненаблюдаетсявысокойгомологиивобластях,соответствующихсубстрат-связывающему домену (см.
пункт 2.1.2), что обеспечивает разнообразиекаталитических свойств, которые вероятнее всего обусловлены физиологическимифункциями DAAO в каждом конкретном организме. Однако стоит отметить, что всамомкаталитическомцентребольшинстваDAAOимеютсянескольковысококонсервативных остатков в районе 189-202, 299-312 и 326-341 (нумерацияTvDAAO), например, Arg302 и Tyr326.28Таблица 2.3Субстратная специфичность оксидаз D-аминокислот из различных источников*.СубстратpkDAAO[67]hDAAO[11,70]RgDAAO TvDAAO[67][67]TvDAAO TvDAAO[69][51,56,57]D-Ala4035719732100D-Val28н.д.**951003979D-Leu21н.д.573230-4027D-Ile35н.д.567630-40н.д.D-Met75н.д.1007810074D-Pro10069572521D-Phe844579368025D-Trp222563810039D-Ser18204122219D-Thr2н.д.10430-402D-Tyr41002617н.д.21D-Cysн.д.н.д.1н.д.0н.д.D-Asnн.д.н.д.40657057D-Gln1н.д.5381н.д.н.д.D-Lys2н.д.517н.д.3D-Arg4н.д.24330-40н.д.D-His3н.д.588888н.д.D-Asp145н.д.400D-Gluн.д.н.д.49<60Glyн.д.63н.д.н.д.0* - Приведены относительные значения активности, ** н.д.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
