Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Например, только за последние 3 года в базе данных трехмерныхбелковых структур (PDB) было депонировано 9 новых структур hDAAO вкомплексе с различными ингибиторами, а эксперименты по белковой инженериине проводятся в настоящее время для этого фермента. С другой стороны, уже более20 лет назад DAAO стала привлекать внимание исследователей с практическойточки зрения для использования в аналитической биотехнологии при созданиибиосенсоров, систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических(шизофрении, болезней Альцгеймера, Паркинсона и др.) и онкологическихзаболеваний, для применения в процессах органического синтеза неприродныхL-аминокислот, α-кетокислот и 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК).Биокаталитический процесс получения 7-АЦК на данный момент является самымкрупнотоннажным и наиболее важным процессом с использованием DAAO,поскольку данное соединение используется в качестве исходного субстрата припроизводстве полусинтетических цефалоспоринов различных поколений.
Стоитотметить,чтовнастоящеевремяцефалоспориныявляютсякрайневостребованными препаратами и по мировому объему продаж занимают первоеместо на рынке антибиотиков (около 10 млрд. долл. в год, 25% от рынка). Средивсех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практикенашли два дрожжевых фермента – из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO) иTrigonopsis variabilis (TvDAAO). Второй фермент является более перспективным,6посколькусредиизученныхонDAAOизначальнообладаетнаилучшейтемпературной стабильностью и наиболее высокой активностью с рядомгидрофобных D-аминокислот и цефалоспорином С. В настоящее время, вторымобширным направлением исследования DAAO является оптимизация свойствприродных DAAO и получение ферментов с заданными свойствами для целейбиотехнологии(повышеннойкаталитическойактивностью,увеличеннойтемпературной и операционной стабильностью, и т.д.). Для решения подобныхзадач применяют различные методы белковой инженерии.
Однако, как показываетопыт, наиболее мощным подходом является метод рационального белковогодизайна, который включает в себя анализ трехмерной структуры интересующегофермента,сравнениеразличныхаминокислотныхисточников,выборпоследовательностейпотенциальныхположенийферментовдляизвведенияаминокислотных замен, компьютерное моделирование, докинг субстратов вактивный центр фермента и т.д.
Выбранные замены вводятся в ген фермента спомощью направленного мутагенеза. Данный подход позволяет осмысленно икомплексно подходить к решению конкретной биотехнологической задачи. Однакоосновным требованием является наличие экспериментальной или модельнойтрехмерной структуры, а также наличие широких знаний о взаимосвязи структурыи функции интересующего фермента. Если в случае RgDAAO трехмернаяструктура была решена еще в 2000 году и с тех пор был накоплен большойэкспериментальный материал по белковой инженерии этого фермента, то дляTvDAAO различным группам исследователей долгое время не удавалось получитькристаллы этого фермента и установить его трехмерную структуру. Тем не менее,за прошедшие 10 лет различие в свойствах RgDAAO и TvDAAO так и не былопреодолено (в первую очередь в случае температурной стабильности). Такимобразом,внастоящеевремяTvDAAOостаетсяотличнойосновойдляэкспериментов по белковой инженерии и направленному изменению свойствприродного фермента.
Стоит отметить, что за это время различными группамиисследователейтакжепроводилисьэкспериментыпокомпьютерномумоделированию структуры TvDAAO, однако полученные модели различались7между собой и не были достаточно точными, что, в первую очередь, связано снизким уровнем гомологии между последовательностями TvDAAO и другимиDAAO с известными структурами, которые были взяты за основу примоделировании.
Этим объясняется весьма ограниченное количество работ побелковой инженерии TvDAAO по сравнению с RgDAAO. Однако ситуацияпоменялась в 2008 году, когда в нашей лаборатории впервые в мире удалосьполучить два кристалла одной из мутантных форм TvDAAO. В результате былаопределена трехмерная структура этого фермента с разрешением 2,8 и 1,8Å,которая до настоящего времени остается единственной доступной cтруктуройTvDAAO. В ходе экспериментов по белковой инженерии, которые начались внашейлабораториис2008года,былопроведеноисследованиерядааминокислотных остатков в структуре TvDAAO, а также получены несколькомутантов с повышенной каталитической активностью и более узким спектромсубстратной специфичности.
В ходе работ по повышению температурной иоперационной стабильности TvDAAO значительных результатов достичь неудалось. Структурно-функциональные исследования, которые были проведеныранее другими исследователями, на данный момент не имеют большогопрактического значения и не представляют теоретического интереса, посколькувыбор аминокислотных остатков для мутагенеза в большинстве случаев не имелпод собой хорошей теоретической базы.Таким образом, целью данной работы является проведение систематическихисследований, направленных на фундаментальное изучение взаимосвязи структурыи функции в оксидазе D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis иполучение мутантных форм фермента с улучшенными свойствами с помощьюрационального белкового дизайна.8II.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ2.1. Оксидаза D-аминокислотОксидаза D-аминокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO) является FAD-зависимойоксидоредуктазой,котораякатализируетстереоспецифичноеокислительноедезаминирование D-аминокислот с образованием соответствующих иминокислот,которые затем неферментативно гидролизуются до α-кетокислот и иона аммония(рис. 2.1). Вторым субстратом является кислород, который в процессе реакциипревращается в пероксид водорода [1–4].Рис. 2.1.
Схема реакции, катализируемой оксидазой D-аминокислот.2.1.1. История открытия, локализация и физиологическая рольОксидаза D-аминокислот впервые была открыта Хансом Адольфом Кребсомв 1935 году во время проведения экспериментов по окислению L- и D-изомероваминокислот с помощью гомогенатов печени и почек свиньи [5]. Начиная с тоговремени DAAO являлась объектом большого числа исследований и сталамодельным ферментом для целого класса FAD-содержащих белков [6]. Всебиохимические свойства DAAO были детально изучены и описаны в период с 1950по 1990 год на примере фермента из почек свиньи (pkDAAO), который долгоевремя представлял собой практически единственную доступную DAAO ввысокоочищенной форме и в количестве достаточном для анализа [7].
С конца 1980стали доступны ферменты из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO) [8] и9Trigonopsis variabilis (TvDAAO) [9]. Не смотря на то, что DAAO из почек человека(hDAAO) была клонирована еще в 1988 году [10], данный фермент был получен ввысокоочищенной гомогенной форме и подробно изучен сравнительно недавно[11].
В целом за последние 70 лет присутствии DAAO было зафиксировано вбольшом количестве живых организмов – в моллюсках, рыбах, рептилиях,амфибиях, насекомых, птицах, различных тканях млекопитающих (мозг, легкие,почки), а также в разнообразных микроорганизмах, таких как водоросли Chlorellavulgaris, микроскопические грибы, дрожжи и бактерии. У экукариотическихорганизмах, например, у дрожжей, DAAO локализована в пероксисомах, где спомощьюкаталазутилизируетсяцитотоксическаяперекисьводорода,образующаяся в результате катализируемой DAAO реакции. Стоит отметить, что взависимости от организма, DAAO выполняет совершенно различные функции[4,7].
Например, основной функцией фермента в микроорганизмах являетсявовлечение экзогенных D-аминокислот в клеточный метаболизм, которые врезультате выступают источниками азота, углерода и энергии, а также защита оттоксического действия ароматических D-аминокислот. У беспозвоночных DAAOвыполняет в основном детоксификациионную роль, у насекомых участвует всинтезе глазного пигмента, в организме светляков также принимает участие вметаболизме D-люцеферина , у рыб участвует в утилизации D-аминокислот вкишечнике и их метаболизме в гепатопанкреасе и почках , у амфибий DAAOявляется ферментом окислительного стресса и способствует регрессии хвостаголовастика во время метаморфоза, у птиц DAAO ускоряет всасываниеD-метионина и некоторых других D-аминокислот в кишечнике .
Недавнопоявилось сообщение, что у плоских червей Dugesia ryukyuensis ферментконтролирует развитие яичников и половое созревание [12]. У млекопитающихDAAOбылаобнаруженавразличныхорганах,гдеонаподдерживаетопределенный уровень D-аминокислот, которые участвуют в регуляции процессовстарения, нервной деятельности, кровяного давления, секреции гормонов и т.д.[4,7,13]. Также DAAO может участвовать в формировании болевого сигнала прионкологических заболеваниях [14]. В настоящее время наибольшее внимание10ученых привлекает физиологическая роль DAAO в организме человека, где оналокализована в различных органах и тканях.
Этот фермент широко распределен вразличных областях мозга и играет исключительно важную роль в поддержанииуровня D-аминокислот. Какие-либо отклонения в функции hDAAO, как правило,приводят к серьезным патологиям в работе центральной нервной системы, однакоподобные взаимосвязи до сир пор остаются до конца неисследованными [15]. Ещев начале 2000-х было установлено, что гены DAAO и pLG72 (белок, которыйпредположительно активирует DAAO) имеют связь с возникновением шизофрении[16].
Повышение экспрессии гена G72 приводит к росту активности hDAAO вмозге человека, что вызывает снижение уровня D-Ser, который в виде свободнойаминокислоты или нейроактивного пептида с высоким сродством можетвзаимодействовать с глицин-связывающим сайтом NMDA-рецепторов [17]. Этоприводит к снижению функциональной активности NMDA-рецепторов, чтоявляется одной из причин возникновения шизофрении [18]. С другой стороны,увеличение концентрации синаптического D-Ser может приводить к развитиюбокового амиотрофического склероза [19]. Кроме того, недавно было показано, чтоDAAO может влиять на систему синтеза дофамина, что может являться второйпричиной возникновения шизофрении у людей [20].
Стоит отметить, чтоNMDA-рецепторы играют важную роль в регуляции таких процессов какобучаемость и память [7], а также связаны с развитием эпилепсии [21] иишемической болезни [22]. Также было показано, что hDAAO участвует врегуляции уровня D-аланина. Например, при болезни Альцгеймера наблюдаетсяповышение общего уровня D-аминокислот в спинномозговой жидкости иувеличение концентрации D-аланина в сером веществе головного мозга более чемв два раза [23].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
