Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 4
Текст из файла (страница 4)
2.2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей DAAO из различных источников.16362362358373348368320320320320312317320316310326317366336305310326294347347347347347347345346362359343348348347342347342347340322340332360361364С этой целью нами были проанализированы первичные последовательностиDAAO из различных организмов. Поиск последовательностей DAAO по базамданных KEGG GENES по ключевому слову D-amino acid oxidase дал более 400результатов. Поиском по базам данных SwissProt, GeneBank и Brenda Enzymesбыло найдено более 100 последовательностей, которые обладали наибольшейгомологией с TvDAAO. После исключения повторов и неверно аннотированныхпоследовательностей для анализа было отобрано 50 последовательностей DAAO,включая исходную TvDAAO, и для них выполнено множественное выравнивание сиспользованием программы CLUSTAL X (версия 1.83).
Результаты представленына рис. 2.2 в порядке убывания гомологии относительно TvDAAO. Наибольшаястепень гомологии (около 35-40%) наблюдается с ферментами из Aspergillus niger,Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Coccidioides posadasii и Neurospora crassa.Интересным является тот факт, что уровень гомологии между дрожжевымиTvDAAOиRgDAAOсоставляетнеболее30%.Стоитотметить,чтоаминокислотные последовательности DAAO из термофильных микроорганизмовдо сих пор не определены. Для поиска и клонирования генов tvdaao изтермофильныхорганизмовнашейгруппойбылиорганизованынаучныеэкспедиции в Кроноцкий государственный заповедник (Камчатка) в 2012-2013 гг.Важной особенностью всех DAAO является наличие вблизи N-концаконсервативной последовательности GXGXXG, которая является характерной длямногих нуклеотидсвязывающих белков [27,28].
Эта последовательность указываетна наличие в молекуле белка структурного элемента, известного как “укладка поРоссману” (Rossman fold), представляющего собой определенную комбинациюα-спиралей и β-листов [29]. Этот структурный домен отвечает за связываниеадениновой части NAD+ и FAD в коферментсвязывающих центрах большинствадегидрогеназ. Стоит отметить, что на С-конце многие DAAO содержатспецифическую последовательность Ser–(Lys/His/Arg)–Leu , которая представляетсобой сигнальный пептид типа 1, обеспечивающий транспорт фермента впероксисомы [30].172.1.3.
Трехмерная структура и механизм действия DAAOНа сентябрь 2014 года в базе данных трехмерных белковых структур (PDB)находится 27 депонированных пространственных структур DAAO из трехисточников – pkDAAO, hDAAO и RgDAAO, среди которых 16 принадлежитhDAAO, 7 структур pkDAAO и 4 структуры дрожжевой RgDAAO (табл. 2.1).Первой среди перечисленных структур была установлена структура для pkDAAO сразрешением 2,6Å. и 3,0Å двумя независимыми группами ученых из Японии иЕвропы в 1996 году [31,32]. В 2000 году была определена структура RgDAAO сразрешением 1,20Å [33], а в 2006 году был получен первый кристалл для hDAAO иопределена структура этого фермента с разрешением 2,5Å [34].
Стоит отметить,что с 2011 года к настоящему моменту было решено 10 структур DAAO, изкоторых 1 для pkDAAO и 9 для hDAAO, что безусловно связано с важнойфизиологической ролью этого фермента в организме человека и активным поискомновых ингибиторов hDAAO для применения в терапии нейродегенеративныхзаболеваний.
Кристаллическая структура TvDAAO долгое время оставаласьнедоступной, несмотря на многочисленные попытки кристаллизации этогофермента во многих лабораториях мира. Различными группами исследователейбыли построены модельные структуры TvDAAO [35,36], однако они различалисьмеждусобой,чтосвязаноснизкимуровнемгомологиимеждупоследовательностями TvDAAO и других DAAO с известной структурой, которыемогут быть взяты за основу при моделировании (см. выше).
Однако в 2008 годуаспиранту нашей лаборатории Хороненковой С.В. впервые в мире удалосьполучить два кристалла одной из мутантных форм TvDAAO. В результате былаопределена трехмерная структура этого фермента с разрешением 2,8 и 1,8Å [4]. Вкачестве примера на рис. 2.3 приведены четвертичные структуры hDAAO иTvDAAO. Кроме того, на рис. 4.1 раздела “Результаты и их обсуждение”представлены трехмерные структуры мономеров pkDAAO, hDAAO, RgDAAO иTvDAAO.ВструктурахможноDAAOвыделить(субстрат-связывающий) и FAD-связывающий домены.18каталитическийТаблица 2.1.Структуры оксидазы D-аминокислот из различных источников.Описание структурыРазрешение Код PDBpkDAAOСвободный фермент, уточненная структура [31]2,5 Å1VE9Комплекс с бензоатом [32]2,6 Å1KIFКомплекс с o-аминобензоатом [37]2,5 Å1AN9Восстановленная форма фермента в комплексе с3,1 Å1DDOиминотриптофаном [38]Комплекс с 3-метил-2-оксовалериановой кислотой [38]3,2 Å1DAOВосстановленный пурпурный интермедиат в комплексе с2,5 Å1EVID-пролином [39]Комплекс с (1R)-1-фенилэтиламин и сульфат-ион [40]1,88 Å3WGThDAAOКомплекс с бензойной кислотой [34]2,5 Å2DU8Свободная холо-форма фермента [41]2,9 Å2E48Комплекс с о-аминобензоатом [41]2,6 Å2E4AКомплекс с иминосерином[41]3,2 Å2E49Комплекс с иминодофамином [41]2,7 Å2E82Комплекс с 4H-фуро(3,2-b)-пиррол-5-карбоновой2,5 Å3CUKкислотой [42]Комплекс с гидроксихинолином-2(1H) [43]2,20 Å3G3EКомплекс с 4H-триен(3,2-b)-пиррол-5-карбоновой1,90 Å3ZNNкислотой и глицерином [44]Комплекс с 4-(4-хлорфенил)-1H-пиррол-2-карбоновой2,30 Å3ZNOкислотой и глицерином [44]Комплекс с 3-гидрокси-2H-хромен-2-он и глицерином2,40 Å3ZNP[44]Комплекс с 3-фенилэтил-4H-фуро(3,2-b)пиролл -52,75 Å3ZNQкарбоновой кислотой [44]Комплекс с пиридин-2,3-диолом [45]2,50 Å3W4IКомплекс с 3-гидрокси-5-(2-фенилэтил)-пиридин-2(1H)2,74 Å3W4Jоном [45]Комплекс с 3-гидрокси-6-(2-фенилэтил)-пиридазин2,86 Å3W4K4(1H)-оном [45]Комплекс с 4-гидрокси-6-[2-(7-гидрокси-2-оксо-4-фенил2,4 Å4QFC2H-хромен-6-ил)этил]пиридазин-3(2H)-оном [46]Комплекс с 3-(7-гидрокси-2-оксо-4-фенил-2H-хромен-62,85 Å4QFDил) пропановой кислотой [46]RgDAAOСвободный фермент [33]1,73 Å1COLКомплекс с D-аланином [33]1,20 Å1COPКомплекс с L-лактатом [33]1,46 Å1COKКомплекс с двумя молекулами антранилата [47]1,9 Å1COI19АБРис.
2.3 Четвертичные структуры hDAAO 3G3E (А) и TvDAAO (Б). FAD выделен CPK.20При ориентации, которая показана на рис. 2.3 (правая субъединица) ирис. 4.1, каталитический домен расположен в верхней части субъединицы ипредставляет собой довольно объемную полость, верхняя часть которой образованаβ-листами. В нижней части этой полости располагается изоаллоксазиновый циклFAD. Кофермент-связывающий домен находится в нижней половине субъединицыи представляет собой классическую укладку по Россману, которая приставляетсобой определенное пространственное расположение α-спиралей и β-листов, чтообеспечивает эффективное связывание аденозиновой части FAD.Несмотря на структурные сходства между RgDAAO, pkDAAO, hDAAO иTvDAAO, анализ трехмерных структур позволяет выявить несколько отличий,объясняющие различие в некоторых свойствах этих ферментов.
Например, вструктуре RgDAAO присутствует петля из 14 аминокислотных остатков,соединяющая между собой β-листы βF5-βF6 (явно выделяется в нижней частисубъединицы на рис. 4.1В). Группой ученых из Италии было показано, что наличиеэтой петли играет ключевую роль в образовании димера RgDAAO за счетвзаимодействия остатков Arg305 и Arg314 (которые располагаются в указаннойпетле) одной субъединицы, и остатков Asp269, Glu275 и Glu276 из α-спиралей I3’ иI3” второй субъединицы [48].
Удаление нескольких аминокислотных остатков изэтой петли приводило к потере способности RgDAAO образовывать димерноесостояние, сильному снижению температурной стабильности и ухудшениюсвязывания FAD [49,50]. В нашей лаборатории были изучены межсубъединичныеконтакты в структуре TvDAAO и роль отдельных остатков в поддержаниистабильного димерного состояния [51]. Была предпринята попытка разрушитьмежсубъединичный контакт, который образован 12 водородными связямиаминокислотных остатков из разных субъединиц.
В рамках данной работы былпроведен направленный мутагенез остатков Arg169 и Arg220, который привел ктому, что мутантные ферменты экспрессировались в клетках E.coli в активной, нонерастворимой форме в виде телец включения. Все полученные мутантныеTvDAAO обладали гораздо более низкой температурной стабильностью, чемфермент дикого типа. В качестве особенности структуры pkDAAO можно отметить21наличие петли βI5-βI6 у входа в активный центр. В результате измененияконформации этой петли в pkDAAO, субстрат попадает в активный центр, апродукт выходит из него.
Таким образом, диссоциация продукта из активногоцентра затруднена и эта стадия лимитирует скорость ферментативной реакции [52].В RgDAAO вход в активный центр немного затрудняет лишь Tyr238, в результатечего этот фермент имеет более высокую каталитическую эффективность, чемpkDAAO. Степень гомологии между hDAAO и pkDAAO составляет более 80%,поэтомумеждуихтретичнойичетвертичнойструктуройнаблюдаетсязначительное сходство [34].
Единственным существенным отличием междуструктурами их субъединиц является различная конформация гидрофобногоучасткаValAlaAlaGlyLysпоследовательностях),остатки(аминокислотныерасположенногосостороны47-51вобеихsi-поверхностиизоаллоксазинового кольца FAD, что обуславливает различие в сродстве этихферментов к FAD.Отдельно стоит упомянуть о различном строении димеров DAAO изразличных источников. В случае RgDAAO и TvDAAO в нативном состоянииферменты существуют в виде димеров, которые состоят из идентичныхсубъединиц, соединенных по типу «голова-хвост» [2,4] (рис. 2.3Б).
Для pkDAAOизвестнодимерноесостояния,вкоторомсубъединицыпространственно-ориентированы «голова-к-голове» друг относительно друга. Необходимо отметить,что для hDAAO различными авторами были получены два типа структуры димера,отличающиеся площадью и способом межсубъединичного контакта – в одномслучае такой контакт реализуется способом «голова-голова» [34], а в другомнаблюдаетсянеобычнаякрестообразнаявзаимнаяориентациясубъединиц(рис. 2.3А) [42]. Важным отличием между структурами hDAAO и pkDAAOявляется олигомерное состояние этих ферментов в живой клетке – фермент изсвиньи существует в виде мономера [6], в то время как активной формой hDAAOявляется димер [42]. Стоит отметить, что все четыре DAAO способны in vitroобразовывать олигомерные состояния более высоких порядков (тетрамеры,октамеры и т.д.), что влияет на каталитическую активность и температурную22стабильность этих ферментов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
