Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 10
Текст из файла (страница 10)
2.2). Все описанные работы, главнымобразом, относились к изучению роли отдельных остатков в катализе pkDAAO.В работе [143] было проведено направленное повышение температурнойстабильности фермента. Авторы обнаружили, что остатки Phe42 и Asn246 вструктуре pkDAAO играют важную роль в стабильности фермента, поскольку49мутанты F42C и N246Y, полученные с помощью неупорядоченного мутагенеза,обладали повышенной температурной стабильностью. В результате в данныхположениях был выполнен насыщающий мутагенез и оказалось, что в 42положении к повышению термостабильности приводит только замена F42C,причем за 60 минут инкубации при 55oС pkDAAO F42C в присутствии 1 мМ FADсохранял около 80% активности, в то время как дикий тип только 10%. Покаталитическим свойствам оба фермента были близки между собой.
ЗаменыN246G, N246E, N246F и N246Y обладали практически одинаковой стабильностьюи чуть большей, чем для фермента дикого типа, однако все ферменты были внесколько раз менее активные. Механизм стабилизации не был выяснен.Изменение субстратной специфичности pkDAAO было предпринято в работе [144],которой завершаются работы по белковой инженерии этого фермента. Авторамибыла показана важная роль последовательности Ile215-Asn225 в молекулярномраспознавании субстратов. Замена этой последовательности на последовательностьArg216-Gly220 D-аспартат оксидазы человека (hDDO) позволило получить мутантсо спектром субстратной специфичности, близким к hDDO, причем мутантныйфермент обладал активностью с D-Asp.
Кроме того, были получены 5 мутантныхформpkDAAOсзаменамиE220D/Y224G,R221D/Y224G,G222D/Y224G,I223D/Y224G, Y224D. В результате введения дополнительного отрицательногозаряда в короткий участок Glu220-Tyr224 и изменение объема полости удалосьзначительно повысить каталитическую эффективность pkDAAO с D-Arg в случаепервых трех мутантов.
однако все мутанты практически потеряли активность сD-Ala и D-Ser, а также сильно снизилась активность с D-Pro и D-Val. Данная работапредставляет собой яркий пример применения метода рационального дизайна дляприданияприродномуферментуновыхсвойств.Отсутствиедальнейшихэкспериментов по белковой инженерии pkDAAO, по-видимому, связано сподробным изучением дрожжевой RgDAAO, которая являлась намного болееинтересным ферментом для целей биотехнологии.502.4.2. Белковая инженерия DAAO из Homo sapiens (hDAAO)В 2000 году для hDAAO, до установления ее трехмерной структуры, былаопубликована статья, в которой авторы описывают получение мутантной формыhDAAO G281C с ковалентно связанным FAD за счет образования связи междуCys281 и 8-метилсульфонил FAD [145]. Положение для мутагенеза было выбранона основе анализа модельной структуры hDAAO, которая была построена наоснове известной структуры pkDAAO.
Мутантный фермент с ковалентносвязанным FAD имел активность в 4 раза ниже, чем фермент дикого типа, азначение KM c D-Ala выросло в 13 раз. По-видимому, структура ферментаизменяется и становится более жесткой, что вызывает ухудшение каталитическихсвойств. Несмотря на то, что подвижность FAD сильно ограничена, он остаетсяправильно ориентированным в активном центре hDAAO, что не приводит кзначительной потере активности. Данная работа представляет собой единственныйпример по белковой инженерии hDAAO и не преследует каких-либо практическихцелей, а носит сугубо теоретический характер.
Подобные результаты могутпривести к большему пониманию природы ковалентного связывания FADразличными белками. В настоящее время масса работ, связанных с hDAAOпосвящена поиску новых ингибиторов этого фермента с целью созданиялекарственныхпрепаратовдлялеченияразличныхнейродегенеративныхзаболеваний (см. пункт 2.1.1 и 2.3.3).2.4.3. Белковая инженерия DAAO из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO)К первой работе по белковой инженерии RgDAAO относится удалениетрипептида Ser-Lys-Leu на конце аминокислотной последовательности фермента в1998 году [146]. Авторами было показано, что этот трипептид является сигнальнойпоследовательностью типа I, отвечающей за транспорт фермента в пероксисомы.Существование RgDAAO дикого типа в виде трех изоформ определяется наличиемили отсутствием трипептида на С-конце одной или двух субъединиц.
Отдельноможно выделить работы по получению химерных ферментов RgDAAO, что былообусловленопрактическиминуждами,51посколькувреальныхпроцессахиспользуют повышенное давление O2, в результате чего снижается операционнаястабильность иммобилизованной RgDAAO. Так был получен химерный белокVHb-RgDAAO с помощью ковалентной пришивки гемоглобина из Vitreoscilla кRgDAAO [147].
Повышение активности в этом случае может быть вызвано двумяпричинами:во-первых,гемоглобинповышаетлокальнуюконцентрациюкислорода, во-вторых, химерный фермент может имеет конформацию, болеевыгодную для окисления цефалоспорина С, по сравнению со свободнымферментом. В результате иммобилизованный препарат такого фермент обладал в 3раза более высокой операционной стабильностью и в 12,5 раз более высокойактивностью с цефалоспорином С, чем иммобилизованная RgDAAO дикого типа.Также для RgDAAO был проведен эксперимент по сшиванию двух мономеровдипептидом Tyr-Thr. Связывание двух субъединиц приводит к повышению TMRgDAAO на 5°С. Стабильность против инактивации H2O2 при этом увеличилась в 2раза.
Каталитическая эффективность с рядом субстратов ухудшилась вследствиеповышения значений KM [148]. В этой же работе было проведено ковалентноесшивание двух субъединиц TvDAAO (см. ниже). Практически все работы побелковой инженерии RgDAAO, после того, как была установлена трехмернаяструктура этого фермента в 2000 году (см. пункт 2.1.3), разделились на дванаправления – получение фермента с заданными свойствами для практическихцелей и исследование роли различных остатков в структуре, катализе истабильности RgDAAO.
Однако оба направления тесно связаны между собой.Одним из наиболее показательных и интересных исследований по инженериисубстратной специфичности RgDAAO является работа [54], в которой былапредпринята попытка радикального изменения субстратной специфичностиRgDAAO. Уже упоминалось, что DAAO обладают очень низкой активностью иливообщенекатализируютокислениеD-Asp–дляэтогосуществуютD-аспартатоксидазы.
Сравнение аминокислотных последовательностей, а такжетрехмерной структуры RgDAAO и модельной структуры DASPO из почки быкапоказало, что в последнем ферменте положение остатка Arg237 эквивалентноположению Tyr238 в структуре RgDAAO. Кроме того, в активном центре RgDAAO52на расстоянии 3,8Å от субстрата находится остаток Met213. Для болееэффективного связывания γ-карбоксильной группы D-Asp были полученыточечныймутантобеспечивающиеRgDAAO M213RвведениевиактивныйдвойнойцентрмутантферментаM213R/Y238R,одногоидвухдополнительных положительных зарядов.
Замена M213R привела к тому, чтовеличина kcat в реакции окисления D-Asp возросла в 8 раз, а значение КM снизилосьв 10 раз по сравнению с таковыми для RgDAAO дикого типа. По своейкаталитической эффективности мутантная RgDAAO не уступала DASPO из почекбыка. В случае двойного мутанта RgDAAO M213R/Y238R величина kcat возросла в53 раза, однако за счет худшей KM, каталитическая эффективность оказалась в двараза ниже, чем для RgDAAO M213R. Замена M213G приводит к существенномуулучшению каталитических свойств фермента с объемными гидрофобнымисубстратами за счет увеличения объема активного центра [55].
Эти работыявляютсяпервымипопыткаминаправленногоизменениясубстратнойспецифичности DAAO, и их успешность позволила надеяться на успех в другихподобных экспериментах. Кроме перечисленных выше примеров мутагенеза,методами белковой инженерии с помощью различных аминокислотных замен былаисследована роль остатков Met213, Tyr223, Tyr238, Arg285, Ser335 и Gln339,располагающихся в активном центре RgDAAO [149].
Замена консервативногоостатка Tyr223 на остаток Ser привела к замедлению связывания субстрата и еговысвобождения в реакции с D-Ala. При этом замена этого же остатка на Phe неизменяет свойств фермента. Из этого следует, что бензольное кольцо Tyr223 играетважную роль в связывании субстрата. Остаток Tyr223 фиксирует субстрат воптимальной для эффективного катализа ориентации за счет электростатических иводородных связей [150]. Также было показано, что остаток Arg283 принимаетнепосредственное участие в катализе – играет важную роль в стабилизацииотрицательного заряда в N(1)-C(2)=O локусе изоаллоксазиновой группировки FAD.Конформация остатка Arg283 изменяется при связывании субстрата, что былопоказано в результате замен R283Q, R283D, R283K, R283A [149,151].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
