Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Поскольку МТОМК являетсяметаболическим предшественником метионаля – сильного индуктора апоптоза, тоданное соединение используется в качестве антиракового средства. Наиболеепростым способом получения МТОМК является ферментативное окислениеD-метионина с помощью DAAO. В работе [112] был предложен эффективный иэкономичный метод получения МТОМК из рацемической смеси D,L-метионина состепенью превращения D-метионина около 98%. Таким образом, в зависимости отпоставленной задачи, может быть подобрана соответствующая ферментативнаясистема для получения оптически чистой L-аминокислоты из смеси D,L-изомеров.Стоит отметить, что могут быть получены оптически чистые D-аминокислоты из39рацематов в аналогичных ферментативных системах с использованием оксидазыL-аминокислот (LAAO) [58].Наиболее крупномасштабным процессом с использованием DAAO являетсяферментативное превращение цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспорановуюкислоту (7-АЦК).
Данный процесс является очень важным, поскольку из 7-АЦКпроизводится более 50% полусинтетических цефалоспориновых антибиотиковразличных поколений. На данный момент рынок цефалоспориновых антибиотиковоценивается более чем в 10 миллиардов долларов США в год [113]. Существуетнеферментативный метод получения 7-АЦК, который заключается в гидролизецефалоспорина С в органических растворителях с использованием токсичныхреагентов [114,115]. Использование химического процесса имеет большоеколичествонедостатков:сложностьидороговизнаочисткипродуктов,использование токсичных реагентов (N,N-диметиланилин), высокоэнергетическиезатраты (из-за низкой температуры процесса (-40°С), органические растворители,малые выходы целевого продукта (<63%) и большое количество побочныхпродуктов.
Биокаталитический процесс, напротив, не имеет вышеперечисленныхнедостатков, однако стоимость разработки биокатализатора высока и трудоемка. Всвязи с постоянным ростом объема производства все больше применяетсяферментативное получение 7-АЦК. Однако на данный момент биферментативныйпроцесс, в котором участвуют DAAO и глутарилгидролаза (рис. 2.6) используетсядляполученияоколо10%отобщеймассыпроизводимой7-АЦК.Впромышленности для этой цели в основном используются RgDAAO и TvDAAO,посколькуониобладаютнаилучшимикаталитическимисвойствамисцефалоспорином С среди изученных оксидаз D-аминокислот.
На первой стадиипроцесса DAAO катализирует окислительное дезаминирование цефалоспорина C собразованиемα-кетоадипил-7-аминоцефалоспоранойкислоты(кетоадипил-7-АЦК), которая, под действием образовавшегося пероксида водорада на первойстадии, неферментативно декарбоксилируется в 7-β-(4-карбокси-бутанамидо)цефалоспорановую кислоту (глутарил-7-АЦК). Затем глутарил-7-АЦК ацилазагидролизует глутарил-7-АЦК, в результате чего образуется целевой продукт –407-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) [116]. Для снижения стоимостиданного процесса осуществляются попытки разработки прямой конверсиицефалоспорина Содновременнымв7-АСА,чтоиспользованиемможетDAAOбытьиреализовано,например,глутарилацилазы[117,118].Окислительное дезаминирование цефалоспорина С под действием DAAO проводятпри рН 7,0-8,0 и температуре 20-30oС. Поскольку в реакции потребляетсякислород, требуется постоянная его подача в реакционную смесь.
Другойпроблемой, связанной с использованием DAAO, является загрязнение природногофермента каталазой и эстеразой. Каталаза за счет гидролиза пероксида водородапрепятствуют протеканию некаталитического декарбоксилирования КА-7-АЦК, аэстеразы неспецифически разрушают сам цефалоспорин С. Проблема легкорешается экспрессией DAAO в рекомбинантных штаммах E.coli, в которыхэстеразы,разрушающиецефалоспорин С,отсутствуют,акаталазаоченьнестабильна и инактивируется в процессе выделения DAAO.
Это было достигнутопутем создания рекомбинантных штаммов E.coli, одновременно экспрессирующихгены DAAO и глутарилацилазы [117,119]. Основным ограничением такого подходаявляется инактивация используемых ферментов образующимся пероксидомводорода. Поэтому была предложена трехферментная система – DAAO,глутарилацилаза и каталаза [120]. Основной недостаток заключается в том, чтоскорость гидролиза глутарил-7-АЦК ацилазой значительно ниже, чем скоростьокисления цефалоспорина С оксидазой D-аминокислот.
Но при длительномпроведении реакции (180 минут), выход 7-АЦК составляет 80%, а негидролизовавшейся глутарил-7-АЦК остается всего 2,5%. Альтернативный способполучения 7-АЦК в одной системе основан на использовании DAAO впермеабилизованных клетках C.pastoris и иммобилизованной глутарилацилазы.Однако целые клетки C.pastoris содержат большие количества каталазы и эстеразы,что может приводить к побочным продуктам. Поэтому перед использованием впроцессе получения 7-АЦК эти два фермента инактивируют щелочами илитермообработкой [121].41OOHNOHNH2OOOHOO2H2O2, NH4+OHSOOCH3OKA-7-ACAOHOOH2O2CephCAcylaseOOHOOHNOHCH3OCephCNH2DAAOSOCO2, H2OH2NGL-7-ACAAcylaseSOOOHO7-ACACH3HNOHOSOOCH3OOOHOHOGL-7-ACAOHOOOРис.
2.6. Получение 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АСА) в две стадии с помощьюбиферментной системы оксидаза D-аминокислот (DAAO) – глутарил ацилаза(GL-7-ACA Acylase) (правая часть схемы) и в одну стадию с использованиемцефаллоспорин C ацилазы (CephC Acylase) (левая часть схемы).Стоит отметить, что в настоящее время предпринимаются попыткиполучения цефаллоспорин С ацилазы с помощью рационального дизайна и методанаправленной эволюции на основе существующей глутарилацилазы [122]. Этотподход может быть использован для одноферментного промышленного получения7-АЦК (рис.
2.6.) [123], однако все полученные мутантные формы ферментаобладают слишком низкой активностью к цефалоспорину С, чтобы вытеснитьсущестющие ферментативные способы получения 7-АЦК2.3.3. Терапия различных заболеванийВ конце 90-годов было установлено, что введение растворов D-аминокислотв организм человека с раковой опухолью замедляет рост раковых клеток.
Быловысказано предположение, что есть связь между активностью DAAO и развитиемрака [124]. Позже исследования на крысах показали, что в раковых клеткахактивность DAAO является нулевой [125]. Это послужило толчком для изучениявозможности применения DAAO в качестве антиракового средства. Былопроведено исследование, в котором мутантную RgDAAO с удаленным сигнальнымпептидом, отвечающим за транспорт в пероксисомы, экспрессировали в клетках 9Lглиомы у мыши [126].
В результате экспрессии DAAO в цитоплазме, происходило42окисление D-Ala с образованием цитотоксичного пероксида водорода. Следуетотметить, что пероксид водорода являлся токсичным как для делящихся клеток, таки для находящихся в покое, потому что значительна часть клеток внутри опухолиможет находится именно в состоянии покоя. Антираковое действие DAAO былопозже подтверждено при использовании pkDAAO, иммобилизованной наполиэтиленгликоле (ПЭГ-pkDAAO) [127]. Такого рода конъюгат показывалхорошие фармокинетические параметры и селективно накапливался в раковыхклетках крыс.
Недавно были созданы наночастицы на основе дрожевой DAAO,состоящие из Fe3O4-3-амино-пропилтриэтоксисилан-DAAO для лечения раковыхклеток [128]. Важно, что в здоровых органах конъюгаты DAAO не накапливаются,и содержание продуктов окислительного метаболизма не изменяется. Одним извозможных объяснений может быть более высокий уровень метаболизма раковыхклеток по сравнению с нормальными, благодаря чему они более активнозахватывают различные соединения из своего окружения. При введении черезнекоторое время в организм крысы D-пролина наблюдалось подавление ростараковых клеток.
В первую очередь это связано с увеличением концентрациипероксида водорода в клетках опухоли. Важно, что в здоровых органах DAAO ненакапливалась,исодержаниепродуктовокислительногометаболизманеизменялось. Интересным является тот факт, что раковые клетки человеческойкарциомы толстой кишки, сначала обработанные конъюгатом ПЭГ-протопорфиринцинка (это вещество является потенциальным ингибитором гем оксигеназы I,которая защищает раковые клетки от окислительного стресса), были болеечувствительны к воздействию цитотоксичных веществ [129]. Таким образом,DAAO в том или ином виде может быть использована в терапии рака, заменивприменение химиотерапии, которая является вредной для всего организма, наместную терапию, относительно безвредную для всего организма в целом.Как отмечалось выше, DAAO играет важную роль в нервной деятельности,регулируя концентрацию D-аминокислот, особенно D-серина.
Было показано, чтонарушения в функции hDAAO сопряжено с различными заболеваниями. Так пришизофрении наблюдается снижение уровня D-серина в сыворотке крови и в43спинномозговой жидкости по сравнению со здоровыми людьми [130], что связано сповышением активности и уровня экспрессии hDAAO [131]. ИспользованиеD-серина и D-аланина в качестве добавок к антипсихотическим препаратам врезультате привело к улучшению состояния больных шизофренией [132,133]. Быловыдвинуто предположение, что введение D-серина вместе с эффективнымиингибиторами hDAAO [134] может увеличить эффективность доставки D-серина вмозг, что может привести к ослаблению симптомов шизофрении.
В связи с этим впоследнеевремяидутактивныеисследованияпопоискуновыхвысокоэффективных ингибиторов hDAAO [135]. При другом нейродегенеративномзаболевании – ишемии, наоборот, нейронные повреждения в основном вызванысильной стимуляцией NMDA-рецепторов, поскольку поврежденные клеткивыделяют D-серин. На крысах было показано, что экзогенная DAAO можетпредотвратить подобные повреждения и развитие болезни [22].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
