Главная » Просмотр файлов » Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна

Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 15

Файл №1105750 Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна) 15 страницаСтруктурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750) страница 152019-03-14СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

Выделение ДНК из геля выполняли с помощьюкоммерчески доступного набора реагентов “DNA extraction kit” фирмы “ThermoScientific”. К вырезанному кусочку геля добавляли 3-х кратный объем (100 мг ≈ 100мкл) “Binding solution” (содержит перхлорат и ацетат натрия) и инкубировали втермошейкере от 5 до 10 минут при 55 0С и 1400 об/мин до полного растворениягеля. Затем смесь переносили в специальные колонки для центрифугирования“GeneJET” и центрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5415D” (13000 об/мин, 1мин). Фильтрат удаляли, в колонки добавляли 500 мкл раствора для промывания(“Wash Solution”) и центрифугировали (13000 об/мин, 1 мин).

Для десорбции ДНКс носителя, колонки помещали в новые пластиковые пробирки на 1,5 мл, добавляли30-50 мкл деионизованной воды или “Elution Buffer”, и затем центрифугировали втечение 1-2 мин при 13000 об/мин.773.2.5. Рестрикция ДНКРестрикциюплазмиднойДНКиПЦР-фрагментовпроводилисиспользованием уникальных эндонуклеаз рестрикции NcoI (10 Ед/мкл), EcoR I (10Ед/мкл), Bsp119I (10 Ед/мкл), XhoI (10 Ед/мкл) фирмы “Thermo Scientific” в одноили двукратном TangoТМ буфере (2Х TangoТМ: 66 мM Трис-ацетат (pH 7,9 при25 °C), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия, 0,2 мг/мл БСА) в соответствии синструкцией производителя.

ДНК инкубировали с требуемой парой рестриктаз при37 ºС в течение 1-1,5 часов в термостате “Гном” (“ДНК-Технология”, Россия).Полноту рестрикции контролировали ДНК-электрофорезом в 1% агарозном геле.3.2.6. Лигирование фрагментов ДНКЛигирование ПЦР-фрагментов после рестрикции в нужный ДНК-векторпроводили коммерчески доступным набором для лигирования “Rapid DNA LigationKit”фирмы“ThermoScientific”согласноинструкциипроизводителя.Втонкостенной пластиковой пробирке на 0,5 мл (“SSI”, США) смешивали 4 мкл5-кратного лигазного буфера (50 мM Трис-HCl (pH 7,8 при 25°C), 10 мM MgCl2,10 мM дитиотреитол, 1мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА), векторную ДНК послерестрикции и встраиваемый ДНК-фрагмент в молярном соотношении 1:3.

Объемлигирующей смеси доводили деионизованной водой до 20 мкл. Смесьцентрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5415D” (13000 об/мин, 30 сек). Затемк смеси добавляли 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4 (до 5 ед/мкл), перемешивали иинкубировали1часпри22С.Полученнойлигазнойсмесью(5 мкл)трансформировали клетки E.

coli DH5α.3.2.7. Трансформация клеток E. coliДля приготовления компетентных клеток E.coli разбавляли 40 мкл ночнойкультуры в 100 раз средой 2YT, пробирки помещали в качалку (37ºС, 160-180об/мин) и выращивали в течение 1,5-2,5 часов до достижения поглощения клетокна длине волны 600 нм А600 ≈ 0,07-0,10. Затем 3 мл культуральной жидкости в дваприема центрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5804R” (5000 об/мин, 5 мин,+4ºС). После удаления культуральной жидкости осадок клеток ресуспендировали в78800 мкл стерильного охлаждённого 50 мМ раствора CaCl2 и инкубировали втечение 30-40 мин во льду. Далее клетки осаждали в условиях, описанных выше,ресуспендировали в 100 мкл охлаждённого 50 мМ CaCl2 и оставляли на 3-4 ч при0ºС.К суспензии клеток добавляли 0,5-1,0 мкл раствора плазмидной ДНК(концентрация ≈50 нг/мкл) или 5,0 мкл реакционной смеси после лигирования иинкубировали в течение 40 мин при 0ºС. После этого клетки подвергали тепловомушоку при 42ºС в водном термостате (точность термостатирования ±0,1ºС) в течение1,5-2,0 мин и охлаждали до 0ºС (1-2 мин).

Затем в пробирку с клетками добавляли900 мкл среды 2YT, трансформированные клетки подращивали в течение 1,5-2 чпри 37ºС при периодическом перемешивании и высевали на чашки Петри с твердойагаризованной средой 2YT (содержание агара 1,2%), которая содержаланеобходимый антибиотик для контроля. В случае трансформации в штаммыE.coli DH5α использовали канамицин в концентрации 30 мкг/мл, в случаетрансформации в штаммы E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus – канамицин(30 мкг/мл), хлорамфеникол (25 мкг/мл) или тетрациклин (8 мкг/мл).3.2.8.

Выделение плазмидной ДНК из клеток E. сoliВыделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора “GeneJetTMPlasmidMiniprepKit”фирмы“ThermoScientific”согласноинструкциипроизводителя. С чашек Петри колонии клеток E.coli DH5α, содержащихтребуемые плазмиды с генами tvdaao, переносили в 4 мл среды 2YT, котораясодержала 30 мкг/мл канамицина и инкубировали 12-16 часов при 37 ºС при 180об/мин. Клетки осаждали в два приема по 1,5 мл в 2 мл пробирках на центрифуге“Eppendorf 5804R” (5000 об/мин, 5 мин, +4 ºС), супернатант удаляли. Далее всеоперации проводили при комнатной температуре.

Осадок клеток тщательноресуспендировали пипетированием в 250 мкл раствора для ресуспендирования(“Resuspension Solution”). Затем добавляли 250 мкл лизирующего раствора (“LysisSolution”) и аккуратно перемешивали, пока раствор не становился прозрачным ивязким.Далеексмесидобавляли35079мклнейтрализующегораствора(“Neutralization Solution”) и аккуратно перемешивали. Смесь центрифугировали нацентрифуге “Eppendorf 5415D” (13000 об/мин, 5 мин), супернатант переносили вспециальные колонки для центрифугирования “GeneJET” и центрифугировали(13000 об/мин, 1 мин). Фильтрат удаляли, в колонки добавляли 500 мкл растворадля промывания (“Wash Solution”) и центрифугировали (13000 об/мин, 1 мин),процедуру повторяли еще один раз. Добавляя в колонки 40-50 мкл деионизованнойводы или буфера для элюирования (“Elution Buffer”) и затем центрифугируя втечение 2 мин при 13000 об/мин, осуществляли десорбцию ДНК с колонок.Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью электрофореза вагарозном геле.

Полученные образцы плазмидных ДНК хранили при -20оС.3.2.9. Секвенирование ДНКСеквенирование плазмидной ДНК проводили в Центре коллективногопользованияЦКП«Геном»(Институтмолекулярнойбиологииим.В.А.Энгельгардта РАН) помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™Terminator v.3.1 (“Perkin Elmer Applied Biosystems”, США), который основан надидезокситерминационном методе, с последующим анализом продуктов реакциина автоматическом секвенаторе ДНК “ABI PRISM 3730 Applied Biosystems”. Дляобработки результатов секвенирования использовали программу Chromas (версия1.45),множественноевыравниваниенуклеотидныхпоследовательностейвыполняли с помощью программы BioEdit (версия 7.1.3.0).3.2.10. Экспрессия TvDAAO в клетках E.coliЭкспрессию TvDAAO и ее мутантов проводили в клетках E.coli BL21 (DE3)pLysS Codon Plus. Для получения штамма-продуцента компетентные клетки E.coliBL21 (DE3) pLysS Codon Plus трансформировали плазмидной ДНК, несущей генtvdaao и высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей канамицин(30 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) или тетрациклин (8 мкг/мл).

С чашкиотбиралиединичнуюколониюикультивироваливтечениеночинамодифицированной среде 2YT в присутствии глюкозы (5 г/л), канамицина(30 мкг/мл) и хлорамфеникола (25 мкг/мл) или тетрациклина (8 мкг/мл) при 37ºС и80180 об/мин. Утром клетки пересевали на свежую среду 2YT (разбавление в 100 раз)и культивировали при 37ºС и 180 об/мин до достижения величины поглощения на600 нм A600≈1,0. Посевной материал вносили в колбы для культивирования вколичестве 10% от общего объема среды, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 5г/л глюкозы. Затем клетки снова пересевали на свежую среду 2YT (разбавление в10 раз) в конические колбы с отбойниками объёмом 1 л (объем среды составлял неболее 15% от объема колбы) и культивировали при 30ºС и 90 об/мин.

Примерно за1 час до индукции в среду добавляли рибофлавин и D-метионин до концентрации80 мг/л и 0,5 мМ соответственно. Затем при поглощении клеток на 600 нм A600≈1,0осуществляли индукцию экспрессии гена tvdaao добавлением в среду ИПТГ доконцентрации 0,1 мМ. После индукции клетки культивировали в течение 8-10часов при 22 ºС и 90 об/мин, каждые 2 часа отбирая пробы по 1,5 мл среды склетками из каждой колбы. В пробах измеряли величину поглощение на 600 нм,клетки осаждали на центрифуге “Eppendorf 5415D” (1 мин, 6000 об/мин), дляконтроля за лизисом клеток измеряли активность TvDAAO в культуральнойжидкости.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6548
Авторов
на СтудИзбе
300
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее