Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Выделение ДНК из геля выполняли с помощьюкоммерчески доступного набора реагентов “DNA extraction kit” фирмы “ThermoScientific”. К вырезанному кусочку геля добавляли 3-х кратный объем (100 мг ≈ 100мкл) “Binding solution” (содержит перхлорат и ацетат натрия) и инкубировали втермошейкере от 5 до 10 минут при 55 0С и 1400 об/мин до полного растворениягеля. Затем смесь переносили в специальные колонки для центрифугирования“GeneJET” и центрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5415D” (13000 об/мин, 1мин). Фильтрат удаляли, в колонки добавляли 500 мкл раствора для промывания(“Wash Solution”) и центрифугировали (13000 об/мин, 1 мин).
Для десорбции ДНКс носителя, колонки помещали в новые пластиковые пробирки на 1,5 мл, добавляли30-50 мкл деионизованной воды или “Elution Buffer”, и затем центрифугировали втечение 1-2 мин при 13000 об/мин.773.2.5. Рестрикция ДНКРестрикциюплазмиднойДНКиПЦР-фрагментовпроводилисиспользованием уникальных эндонуклеаз рестрикции NcoI (10 Ед/мкл), EcoR I (10Ед/мкл), Bsp119I (10 Ед/мкл), XhoI (10 Ед/мкл) фирмы “Thermo Scientific” в одноили двукратном TangoТМ буфере (2Х TangoТМ: 66 мM Трис-ацетат (pH 7,9 при25 °C), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия, 0,2 мг/мл БСА) в соответствии синструкцией производителя.
ДНК инкубировали с требуемой парой рестриктаз при37 ºС в течение 1-1,5 часов в термостате “Гном” (“ДНК-Технология”, Россия).Полноту рестрикции контролировали ДНК-электрофорезом в 1% агарозном геле.3.2.6. Лигирование фрагментов ДНКЛигирование ПЦР-фрагментов после рестрикции в нужный ДНК-векторпроводили коммерчески доступным набором для лигирования “Rapid DNA LigationKit”фирмы“ThermoScientific”согласноинструкциипроизводителя.Втонкостенной пластиковой пробирке на 0,5 мл (“SSI”, США) смешивали 4 мкл5-кратного лигазного буфера (50 мM Трис-HCl (pH 7,8 при 25°C), 10 мM MgCl2,10 мM дитиотреитол, 1мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА), векторную ДНК послерестрикции и встраиваемый ДНК-фрагмент в молярном соотношении 1:3.
Объемлигирующей смеси доводили деионизованной водой до 20 мкл. Смесьцентрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5415D” (13000 об/мин, 30 сек). Затемк смеси добавляли 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4 (до 5 ед/мкл), перемешивали иинкубировали1часпри22С.Полученнойлигазнойсмесью(5 мкл)трансформировали клетки E.
coli DH5α.3.2.7. Трансформация клеток E. coliДля приготовления компетентных клеток E.coli разбавляли 40 мкл ночнойкультуры в 100 раз средой 2YT, пробирки помещали в качалку (37ºС, 160-180об/мин) и выращивали в течение 1,5-2,5 часов до достижения поглощения клетокна длине волны 600 нм А600 ≈ 0,07-0,10. Затем 3 мл культуральной жидкости в дваприема центрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5804R” (5000 об/мин, 5 мин,+4ºС). После удаления культуральной жидкости осадок клеток ресуспендировали в78800 мкл стерильного охлаждённого 50 мМ раствора CaCl2 и инкубировали втечение 30-40 мин во льду. Далее клетки осаждали в условиях, описанных выше,ресуспендировали в 100 мкл охлаждённого 50 мМ CaCl2 и оставляли на 3-4 ч при0ºС.К суспензии клеток добавляли 0,5-1,0 мкл раствора плазмидной ДНК(концентрация ≈50 нг/мкл) или 5,0 мкл реакционной смеси после лигирования иинкубировали в течение 40 мин при 0ºС. После этого клетки подвергали тепловомушоку при 42ºС в водном термостате (точность термостатирования ±0,1ºС) в течение1,5-2,0 мин и охлаждали до 0ºС (1-2 мин).
Затем в пробирку с клетками добавляли900 мкл среды 2YT, трансформированные клетки подращивали в течение 1,5-2 чпри 37ºС при периодическом перемешивании и высевали на чашки Петри с твердойагаризованной средой 2YT (содержание агара 1,2%), которая содержаланеобходимый антибиотик для контроля. В случае трансформации в штаммыE.coli DH5α использовали канамицин в концентрации 30 мкг/мл, в случаетрансформации в штаммы E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus – канамицин(30 мкг/мл), хлорамфеникол (25 мкг/мл) или тетрациклин (8 мкг/мл).3.2.8.
Выделение плазмидной ДНК из клеток E. сoliВыделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора “GeneJetTMPlasmidMiniprepKit”фирмы“ThermoScientific”согласноинструкциипроизводителя. С чашек Петри колонии клеток E.coli DH5α, содержащихтребуемые плазмиды с генами tvdaao, переносили в 4 мл среды 2YT, котораясодержала 30 мкг/мл канамицина и инкубировали 12-16 часов при 37 ºС при 180об/мин. Клетки осаждали в два приема по 1,5 мл в 2 мл пробирках на центрифуге“Eppendorf 5804R” (5000 об/мин, 5 мин, +4 ºС), супернатант удаляли. Далее всеоперации проводили при комнатной температуре.
Осадок клеток тщательноресуспендировали пипетированием в 250 мкл раствора для ресуспендирования(“Resuspension Solution”). Затем добавляли 250 мкл лизирующего раствора (“LysisSolution”) и аккуратно перемешивали, пока раствор не становился прозрачным ивязким.Далеексмесидобавляли35079мклнейтрализующегораствора(“Neutralization Solution”) и аккуратно перемешивали. Смесь центрифугировали нацентрифуге “Eppendorf 5415D” (13000 об/мин, 5 мин), супернатант переносили вспециальные колонки для центрифугирования “GeneJET” и центрифугировали(13000 об/мин, 1 мин). Фильтрат удаляли, в колонки добавляли 500 мкл растворадля промывания (“Wash Solution”) и центрифугировали (13000 об/мин, 1 мин),процедуру повторяли еще один раз. Добавляя в колонки 40-50 мкл деионизованнойводы или буфера для элюирования (“Elution Buffer”) и затем центрифугируя втечение 2 мин при 13000 об/мин, осуществляли десорбцию ДНК с колонок.Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью электрофореза вагарозном геле.
Полученные образцы плазмидных ДНК хранили при -20оС.3.2.9. Секвенирование ДНКСеквенирование плазмидной ДНК проводили в Центре коллективногопользованияЦКП«Геном»(Институтмолекулярнойбиологииим.В.А.Энгельгардта РАН) помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™Terminator v.3.1 (“Perkin Elmer Applied Biosystems”, США), который основан надидезокситерминационном методе, с последующим анализом продуктов реакциина автоматическом секвенаторе ДНК “ABI PRISM 3730 Applied Biosystems”. Дляобработки результатов секвенирования использовали программу Chromas (версия1.45),множественноевыравниваниенуклеотидныхпоследовательностейвыполняли с помощью программы BioEdit (версия 7.1.3.0).3.2.10. Экспрессия TvDAAO в клетках E.coliЭкспрессию TvDAAO и ее мутантов проводили в клетках E.coli BL21 (DE3)pLysS Codon Plus. Для получения штамма-продуцента компетентные клетки E.coliBL21 (DE3) pLysS Codon Plus трансформировали плазмидной ДНК, несущей генtvdaao и высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей канамицин(30 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) или тетрациклин (8 мкг/мл).
С чашкиотбиралиединичнуюколониюикультивироваливтечениеночинамодифицированной среде 2YT в присутствии глюкозы (5 г/л), канамицина(30 мкг/мл) и хлорамфеникола (25 мкг/мл) или тетрациклина (8 мкг/мл) при 37ºС и80180 об/мин. Утром клетки пересевали на свежую среду 2YT (разбавление в 100 раз)и культивировали при 37ºС и 180 об/мин до достижения величины поглощения на600 нм A600≈1,0. Посевной материал вносили в колбы для культивирования вколичестве 10% от общего объема среды, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 5г/л глюкозы. Затем клетки снова пересевали на свежую среду 2YT (разбавление в10 раз) в конические колбы с отбойниками объёмом 1 л (объем среды составлял неболее 15% от объема колбы) и культивировали при 30ºС и 90 об/мин.
Примерно за1 час до индукции в среду добавляли рибофлавин и D-метионин до концентрации80 мг/л и 0,5 мМ соответственно. Затем при поглощении клеток на 600 нм A600≈1,0осуществляли индукцию экспрессии гена tvdaao добавлением в среду ИПТГ доконцентрации 0,1 мМ. После индукции клетки культивировали в течение 8-10часов при 22 ºС и 90 об/мин, каждые 2 часа отбирая пробы по 1,5 мл среды склетками из каждой колбы. В пробах измеряли величину поглощение на 600 нм,клетки осаждали на центрифуге “Eppendorf 5415D” (1 мин, 6000 об/мин), дляконтроля за лизисом клеток измеряли активность TvDAAO в культуральнойжидкости.