Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Осадок клеток ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфера (0,5 мг/мллизоцим, 0,2% об Тритон Х-100, 0,1 М КФБ, рН 8,0), замораживали при –20ºС втечение 30 минут, затем инкубировали в шейкере в течение 2-3 часов. Осадокразрушенных клеток осаждали центрифугированием и определяли активностьTvDAAO в супернатанте (см. раздел 3.2.14). После окончания культивированияколбы помещали в лед, охлаждали 10-20 минут и клетки осаждали на центрифуге“Eppendorf 5804R” (6000 об/мин, 5 мин, +4ºС). Полученный осадок клетокресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl рН 8,0 в соотношении 1:4 (масс) и помещалина -20ºС.3.2.11.
Выделение и очистка TvDAAOКлеткиE.coli,содержащиеTvDAAO,разрушалисиспользованиемультразвукового дезинтегратора “Branson Sonifier 250” (Германия) при постоянномохлаждении в течение 4-5 минут. После чего суспензию разрушенных клетокцентрифугировали на центрифуге “Eppendorf 5804R” (13000 об/мин, 30 минут,81+4ºС). Полученный бесклеточный экстракт фильтровали через фильтр с диаметромпор 0,45 и 0,22 мкм. Затем проводили очистку TvDAAO с помощьюанионообменной хроматографии на колонке MonoQ HR 10/10 с использованиемприбора FPLC “ÄKTA Purifier” фирмы “GE Healthcare” (Великобритания). Растворфермента наносили на колонку в 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0. Десорбцию TvDAAOпроводили в линейном градиенте 0-300 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0 соскоростью 2,0 мл/мин в течение 80 минут, контролируя активность TvDAAO всобранных фракциях.
Заключительной стадией очистки являлась гель-фильтрацияна колонке 1 x 25 см с носителем Sephadex G-25 (“Pharmacia”, Швеция) в 0,1 МКФБ, рН 8,0. Чистоту мутантных TvDAAO и фермента дикого типа определяли спомощью белкового электрофореза в денатурирующих условиях.3.2.12. Белковый электрофорез в денатурирующих условияхЭлектрофорез белков по методу Лэммли проводили на приборе MiniproteanII фирмы “BioRad” (США) по протоколам фирмы-изготовителя. Используемыерастворы:1.
Буфер 1: 1,5 М Трис-HCl, рН 8,8.2. Буфер 2: 0,5 М Трис-HCl, рН 6,8.3. Смесь Акриламид/Бис-акриламид в соотношении 36,5:1.4. 10%-ный раствор SDS Na.5. Буфер для нанесения образцов: 1 мл буфера 2, 0,8 мл глицерина (100%),1,6 мл 10%-го SDS, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола, 0,4 мл 1%-ныйбромфенолового синего, 3,8 мл деионизованной воды.6. 5-кратный электродный буфер, рН 5,3: 15г/л Трис-НСl, 72 г/л глицин , 5г/л SDS7. Раствор для окраски геля: 0,1% Кумасси R-250, 40% этанол и 10%уксусной кислоты.Состав разделяющего геля (12%): деионизованная вода - 3,35 мл, буфер 1 2,5 мл, 10%-ный SDS - 100 мкл, акриламид/бис-акриламид - 4 мл, 10%-ный(NH4)2S2O8 - 50 мкл, ТЕМЕД - 5 мкл.82Состав концентрирующего геля (4%): деионизованная вода - 6,1 мл, буфер 2- 2,5 мл, 10%-ный SDS - 100 мкл, акриламид/бис-акриламид - 1,33 мл, 10%-ный(NH4)2S2O8 - 50 мкл, ТЕМЕД - 10 мкл.К пробе TvDAAO добавляли 10-50 мкл воды, 50 мкл буфера для нанесенияобразцов и инкубировали при 95 ºС в течение 15 минут.
Электрофорез проводили врекомендованных фирмой-производителем условиях (60 В по верхнему и 120 В понижнему гелю) до тех пор, пока краска не выйдет из геля. Для визуализации полосбелка, гель помещали в раствор для окраски на 30-60 минут. Затем проводилиотмывку фона после окрашивания дистиллированной водой в течение 12-14 часов.Чувствительность окраски с помощью Кумасси R-250 составляет 1 мкг белка вполосе.3.2.13. Определение концентрации ферментаКонцентрацию активной TvDAAO определяли по концентрации окисленногоFAD, измеряя поглощение на длине волны 455 нм на спектрофотометреUV-1601PC (“Shimadzu”) с использованием коэффициента молярного поглощения10800 М-1см- 1[71].Верностьданногометодабылаподтвержденадополнительными экспериментами по определению концентрации мутантныхTvDAAO и фермента дикого типа с помощью метода Брэдфорда [165] имодифицированного биуретового метода совместно с группой А.В.
Левашева.Концентрации различных препаратов TvDAAO, определенные тремя различнымиспособами, различались не более, чем на 10% между собой.3.2.14. Определение активности TvDAAOДля определения активности TvDAAO использовали перекрестную реакциюс участием пероксидазы из корней хрена. В качестве субстрата для TvDAAOиспользовали D-метионин, для пероксидазы из корней хрена – АБТС. Вспектрофотометрическую кювету (рабочий объем 1 мл, оптический путь 1 см)добавляли насыщенный воздухом 50 мМ КФБ, рН 8,0 и 100 мМ раствор D-Met в 50мМ КФБ (в сумме 970 мкл).
После термостатирования кюветы в течение 10 минут30ºС в нее добавляли 20 мкл водного раствора АБТС (16 мг/мл) и83термостатировали еще 2 минуты. Затем в кювету добавляли 10 мкл растворапероксидазы в 50 мМ КФБ (5 мг/мл) и пробу TvDAAO (30 мкл). Определениеактивности проводили по накоплению продукта окисления АБТС на длине волны414 нм (ε414=36000 М-1см-1) на спектрофотометре UV-1800 (“Shimadzu”).3.2.15. Определение каталитических параметров TvDAAOДля определения величин максимальной скорости ферментативной реакциии константы Михаэлиса, концентрацию соответствующей D-аминокислотыварьировали в диапазоне от 0,5 до 5 КM, ориентируясь на значения КM дляTvDAAO дикого типа.
В случае большого отклонения значения КM для мутантнойTvDAAO от такового для фермента дикого типа проводили повторное измерение сучетом полученного значения КМ. Активность TvDAAO при каждой концентрацииD-аминокислоты измеряли не менее 3 раз. Кинетические параметры VmрассчитывалиметодомнелинейнойрегрессииспомощьюиКMпрограммыOriginPro 8.5 SR1 (OriginLab Coroporation, США). Каталитическую константу kcatрассчитывали из значения Vm.3.2.16.
Изучение температурной стабильности TvDAAOТемпературная стабильность мутантных TvDAАO и фермента дикого типаизучалась в 0,1 М КФБ, рН 8,0 при различных температурах с шагом 2ºС. Дляэксперимента готовились серии из тонкостенных пластиковых пробирок объемом0,5 мл в которые помещали по 100-110 мкл фермента.
Пробирки инкубировали вводном термостате при необходимой температуре (точность термостатирования±0,1 оС).Черезопределенныепромежуткивременипробиркивынимали,охлаждали в течение 1-2 мин во льду и измеряли активность. Экспериментостанавливали после уменьшения активности фермента до 5-10% от исходнойвеличины. Для расчета кинетических параметров процесса инактивации мутантныхTvDAAO строили зависимости остаточной активности от времени и анализировалис помощью программы OriginPro 8.5 (OriginLab Coroporation, США) методомнелинейной регрессии.843.2.17.
Математический аппарат теории диссоциативной термоинактивацииТермоинактивация мутантных TvDAAO и фермента дикого типа проходилав соответствии с диссоциативным механизмом (схема 1.1). Для определенияконстант скоростей термоинактивации использовали математический аппарат,подробно описанный в работах О.М.Полторака [79,166]. Расчет k1 и k-1 проводилсяна стадии диссоциации димера на мономеры до точки излома в соответствии свыражением:2v 1 v 3F (v) 2 k 1tv0 2 v0 2где v – активность фермента на участке до точки излома и k1 определяют изтангенса угла наклона зависимости F(v) от t.
Для определения константыдиссоциации расчет производился по следующей формуле:4E 0 v0 v x k 1 k 1v0 v x2K disгде vo и vx – начальная активность и активность в точке изломасоответственно, [E]0 – начальная концентрация димеров TvDAAO. Из наклоназависимостиостаточнойактивностиотвременивполулогарифмическихкоординатах после точки излома определяли эффективную константу скоростиинактивации второй стадии k2эф.
Истинную константу скорости инактивациивторой стадии k2 вычисляли по следующему уравнению:k2эф (v0 vx )k2 2(v0 vx )85IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ4.1. Роль остатка Met104 в каталитических свойствах и стабильностиTvDAAO4.1.1. Анализ трехмерной структуры TvDAAO и компьютерное моделирование.Для получения подробных сведений о взаимосвязи структуры, стабильностии активности TvDAAO, а также для объяснения более высокой температурнойстабильности TvDAAO по сравнению с изученными DAAO, нами был проведенсравнительный анализ проаннотированных аминокислотных последовательностейDAAO из различных организмов (рис.
2.2), а также подробный анализ известных наданныймоменттрехмерныхструктурDAAO(рис 4.1 А-Г).Результатыэкспериментов показали, что аминокислотная последовательность TvDAAO имеетнизкую гомологию с другими DAAO. Например, дрожжевые TvDAAO и RgDAAOимеют уровень гомологии всего 30%. Тем не менее, известные четвертичныеструктуры pkDAAO, hDAAO, RgDAAO и TvDAAO довольно схожи между собой(рис 4.1 А-Г). Выравнивание пространственных структур TvDAAO и RgDAAO(рис.
4.2) позволило выявить основные структурные отличия. Так, RgDAAO вобластисвязыванияFADимеетдополнительнуюпетлю(нижняячастьсубъединицы, рис. 4.2), роль которой в поддержании димерного состояния истабильности RgDAAO была подробна изучена в работах [48–50]. С другойстороны, подробное сравнение трехмерных структур различных DAAO показало,что характерным структурным отличием TvDAAO является наличие болеедлинной петли в области активного центра, которая располагается с 95 по 120остаток в последовательности TvDAAO и соединяет два β-листа (85-94 и 121-125остатки)ивзаимодействуетспространственно-сближеннымиэлементамивторичной структуры (α-спираль 58-78, β-листы 88-94, 121-125, 135-141, 226-230,255-260, соединительные петли 51-57, 231-241).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
