Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Энтропии активации S# для всехмутантных ферментов, кроме TvDAAO M104L и M104F несколько выше, чем дляфермента дикого типа. Самое высокое значение S# наблюдается для заменыM104I. На второй стадии термоинактивации активационные параметры H# и Eaдля мутантных TvDAAO M104S, M104W и фермента дикого типа близки междусобой.
Выделяются высокие значения всех активационных параметров дляTvDAAO M104A, M104V, M104I, M104L, M104F, M104Y и , в меньшей степени,для M104S. Действительно, из рис. 4.16 следует, что именно для этих мутантовугол наклона зависимостей больше, чем для фермента дикого типа, чтосоответствуетростутермоинактивациисстабильностипонижениемэтихферментовтемпературы.навторойПолученныестадиизначенияактивационных параметров являются достаточно высокими по сравнению собычными химическими реакциями и характерны для процессов, связанных сразворачиванием белковой глобулы.
Изменение параметров активации может бытьобъяснено изменением структуры TvDAAO в результате введения различных118замен в 104 положение. Так, введение ароматических замен M104F, M104Y иM104W может приводить к усилению, например, гидрофобных взаимодействий икомпактизации белковой глобулы, что в результате приводит к повышениютемпературной стабильности.Таблица 4.9.Активационные параметры первой и второй стадий инактивации мутантныхTvDAAO с заменами в 104 положении и фермента дикого типа(0,1 М КФБ, рН 8,0).1я стадия инактивацииS#,#Ea,H ,2я стадия инактивацииS#,#Ea,H ,ФормаTvDAAOкДж/мольДж/(моль*К)кДж/молькДж/мольДж/(моль*К)кДж/мольДикий тип237±18420±40240±17185±11260±30187±10M104A254±20480±70256±20320±30680±94322±30M104S244±20440±60247±20230±30400±90232±30M104V255±30480±80258±30305±20630±60316±15M104I286±20570±60289±20282±18560±50285±18M104L230±17400±50239±17290±30580±80294±20M104F233±12400±40236±13260±20470±60263±20M104Y256±15470±40259±15277±30530±80280±30M104W251±8460±20254±10198±15300±40201±15M104E258±11490±30260±11262±10500±20265±10M104K190±20280±60192±20196±6300±20199±61194.1.5.
Влияние замен Met104Glu и Met104Lys на свойства TvDAAOС точки зрения влияния на каталитические свойства и стабильностьTvDAAO также представляют интерес замены остатка Met104 на заряженныеаминокислотные остатки. В качестве таких замен нами были выбраны остатки Gluи Lys, которые при pH рабочего буфера (pH 8.0) несут отрицательный (pKa≈4.1) иположительный (pKa≈10.8) заряды на своих боковых радикалах, соответственно.Кроме того, эти аминокислоты являются структурно-близкими к метионину,следовательно, такие замены не должны приводить к увеличению доступаактивного центра фермента растворителю. На рис. 4.17 представлены результатыкомпьютерного моделирования структуры TvDAAO в области активного центра сзаменами M104E и M104K.БAРис.
4.18. Компьютерное моделирование замен M104E (A) и M104K (Б) в структуреTvDAAO. Пунктиром показаны водородные связи.В случае введения замены M104E возможно образование новой водороднойсвязи между карбоксильной группой и боковым радикалом соседнего остаткаSer105. В случае обеих замен, боковые радикалы вводимых остатков смотрят всторону активного центра и, таким образом, могут взаимодействовать с боковымирадикалами D-аминокислот в процессе катализа.Получение мутантных TvDAAO с заменами M104E и M104K было описано впункте 4.1.2.
Результаты экспрессии и очистки представлены в таблице 4.2.120Аналитический SDS-электрофорез очищенных образцов TvDAAO M104E и M104Kв полиакриламидном геле показал, что все препараты имели чистоту не менее 95%(рис. 4.19).Рис. 4.19. Белковый электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях (препараты TvDAAO 1-4 после очистки и 5-8 после разрушенияклеток). 1 – TvDAAO M104E, 2 – TvDAAO M104K, 3 – TvDAAO Del_99-110, 4– TvDAAO дикого типа, 5 – TvDAAO Del_99-110 (клеточные стенки послеразрушения клеток УЗ), 6 – TvDAAO Del_99-110 (бесклеточный экстрактпосле разрушения клеток УЗ), 7 – TvDAAO дикого типа (клеточные стенки), 8– TvDAAO дикого типа (бесклеточный экстракт), M – маркер (мол. массыуказаны в кДа).На следующем этапе были изучены кинетические свойства и температурнаястабильность TvDAAO M104E и M104K.
Полученные значения kcat, КМ и kcat/KМ снабором D-аминокислот приведены в таблице 4.2. Зеленым цветом и полужирнымшрифтом выделены те случаи, когда наблюдается улучшение каталитическихпараметров с данным субстратом.Введение замены M104E практически не повлияло на значения КМ сомногими D-аминокислотами, в то время как замена M104K привела к увеличениюКМ со всеми субстратами, кроме D-Leu (рис.
4.20, табл. 4.2).С точки зрения каталитической активности, обе мутантные TvDAAO похожимежду собой с большинством субстратов. С D-Ala, D-Val и D-Ser значения kcat121уменьшились в среднем в 5-10 раз. TvDAAO M104E неактивен с D-Thr,TvDAAO M104K неактивен с D-Thr и D-Ser (рис. 4.21, табл. 4.2).МутантTvDAAO M104Eобладаетповышеннойкаталитическойэффективностью с D-Leu (в 6 раз), с D-Phe (в 2,4 раза), с D-Tyr (в 1,4 раза) и D-Trp(в 1,7 раза). Для мутантной TvDAAO M104K каталитическая эффективность совсеми субстратами ниже, чем для фермента дикого типа из-за роста значений КМ(рис.
4.22, табл. 4.2).Интересным моментом является то, что каталитическая активность с D-Lys вслучае замены M104E возросла почти в 18 раз, а для замены M104K упала почти в3 раза по сравнению с ферментом дикого типа (рис. 4.21, табл. 4.2). Другимисловами, с D-Lys мутантная TvDAAO M104E проявляет в 48 раз более высокуюкаталитическую активность, чем TvDAAO M104K. В то же время, оба ферментаTvDAAO M104E и TvDAAO M104K не проявляют активности с D-Glu и D-Asp.По-видимому, в процессе катализа боковые радикалы отрицательно заряженногоGlu104 и положительно заряженного Lys104 (в результате замен M104E и M104K)взаимодействует с положительно заряженным боковым радикалом D-Lys, при егосвязывании в активном центре фермента, что и определяет активность мутантныхферментов с этим субстратом.
При связывании D-Glu и D-Asp, вероятно, ихвзаимодействия с аминокислотными остатками на входе в активный центр носятболее сложный характер, поэтому замена M104K не приводит к возникновениюактивности с данными субстратами. Таким образом, мутантная TvDAAO M104Eможет быть использована для селективного определения D-Lys в различныхобразцах, а также для его эффективного окисления в процессах тонкогоорганического синтеза.122Рис. 4.20.
Относительные значения констант Михаэлиса (КМ) для мутантных TvDAAO с заменами Met104Glu и Met104Lys.За 100% приняты значения КМ фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.123Рис. 4.21. Относительные значения каталитических констант (kcat) для мутантных TvDAAO с заменами Met104Glu и Met104Lys.За 100% приняты значения kcat фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.124Рис. 4.22. Относительная каталитическая эффективность (kcat/КМ) для мутантных TvDAAO с заменами Met104Glu и Met104Lys.За 100% принята каталитическая эффективность фермента дикого типа с каждой D-аминокислотой.125ТемпературнаястабильностьмутантныхTvDAAO M104EиTvDAAO M104K была изучена при температурах от 48 до 56°C. Как и в случаедругих мутантных TvDAAO с заменами остатка Met104 и фермента дикого типа,термоинактивация TvDAAO c заменами M104E и M104K протекала подиссоциативному механизму в исследованном температурном диапазоне 48-56°С.На рис.
4.23 приведены зависимости остаточной активности от времени при 54°C,аппроксимированные биэкспоненциальными функциями.T = 54 oC, 10 мкг/млОстаточная активность, A/Ao1,0wt-TvDAAOTvDAAO M104ETvDAAO M104K0,80,60,40,20,0020406080100Время, минРис. 4.23. Зависимости остаточной активности от времени для TvDAAO M104E (▲,─),TvDAAO M104K (▼,─) и TvDAAO дикого типа (■,─).
Экспериментальныхданные аппроксимированы биэкспоненциальными функциями. Концентрацияферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0, температура инкубации 54°С.Результатырасчетаконстантскоростидляобеихстадийпроцессатермоинактивации и периодов полуинактивации приведены в таблицах 4.7 и 4.8соответственно. При сравнении данных таблицы 4.7 и рис. 4.23, видно, чтомутантные формы TvDAAO M104E и TvDAAO M104K близки между по собой потемпературной стабильности, но менее стабильны, чем фермент дикого типа, чтосвязаносувеличениемконстантскороститермоинактивации.126обеихстадийпроцесса-11wt-TvDAAOTvDAAO M104ETvDAAO M104Kln(k1/T)-12-13-14-150,003000,003030,003060,003090,00312-11/T, KАwt-TvDAAOTvDAAO M104ETvDAAO M104K-12ln(k2/T)-13-14-150,003000,003030,003060,003090,00312-11/T, KБРис. 4.24.
Температурные зависимости констант скорости первой (k1/T от 1/T, А) и второй(k2/T от 1/T, Б) стадий термоинактивации для TvDAAO M104E (▲,─),TvDAAO M104K (▼,─) и TvDAAO дикого типа (■,─). Концентрацияферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0.127На рис. 4.24 приведены зависимости констант скоростей первой и второйстадий инактивации в обратных полулогарифмических координатах ТАК для обеихмутантных форм и TvDAAO дикого типа. Видно, что для TvDAAO M104Eконстанты скорости обеих стадий процесса термоинактивации сильнее зависят оттемпературы по сравнению с TvDAAO M104K и ферментом дикого типа.
Врезультате TvDAAO M104E менее стабилен, чем фермент дикого типа во всемизученном температурном диапазоне и эффект дестабилизации для обеих стадийувеличивается с температурой. Однако при температуре ниже 48°С постабильности данный мутант сравним с ферментом дикого типа на каждой стадиитермоинактивации. Для мутантной формы TvDAAO M104K температурныезависимости констант обеих стадий практически не изменились по сравнению стаковыми для фермента дикого типа, однако по абсолютному значению находятсявыше, что говорит о меньшей температурной стабильности мутантного ферментаво всем изученном температурном диапазоне. Для обеих стадий процессатермоинактивации также были рассчитаны активационные параметры (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
