Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Замены на незаряженные M104A,M104S, M104V, M104I и заряженные остатки M104E, M104K дестабилизировалифермент, замена M104L практически не оказала влияния на стабильность, в товремя как введение ароматических аминокислот привело к значительнойстабилизации фермента, особенно в случае замены M104F. Данная особенность135указывает на то, что при введение ароматических аминокислотных заменосновополагающейпричинойстабилизацииTvDAAOможетявлятьсянеэкранирование активного центра фермента от растворителя объемным остатком, авзаимодействие с близкорасположенными аминокислотными остатками, в первуюочередь с Phe54 и Phe258, что в конечном счете может приводить к усилениювзаимодействий между пространственно-сближенными элементами вторичнойструктуры (с β-листом 255-260 и соединительной петлей 51-57) и стабилизациивсей белковой глобулы TvDAAO.
Для проверки данной гипотезы требуютсядополнительныеэкспериментыпонаправленномумутагенезублизкорасположенных остатков в области входа в активный центр TvDAAO, чтобудет являться предметом обсуждения следующей главы 4.2.1364.2. Изучение взаимодействия между остаткамив 54, 104 и 258 положенияхВ результате направленного мутагенеза остатка Met104 были полученымутантные формы TvDAAO M104F, TvDAAO M104Y и TvDAAO M104W, которыеобладают повышенной температурной стабильностью по сравнению с ферментомдикого типа. Причинами стабилизации могут быть усиление взаимодействий ссоседними аминокислотными остатками, экранирование активного центра отрастворителя, а также предотвращение окисления остатка Met104.
Вероятно,каждый из перечисленных факторов в той или иной степени вносит свой вклад встабилизацию фермента. Интересным является тот факт, что наибольшейтемпературной стабильностью обладает мутантная TvDAAO с заменой M104F.Остаток Phe не является самым объемным, однако является наиболее гидрофобнымсреди всех введенных замен. Тем не менее, стабилизационный эффект не можетбыть объяснен только гидрофобными взаимодействиями, поскольку, например,замена M104L практически не повлияла на температурную стабильность TvDAAO,хотя остаток Leu близок по размеру к остатку Met, но при этом является болеегидрофобным [170].
Другими словами, при усилении только гидрофобныхвзаимодействийстоилоожидатьболеевысокуютермостабильностьTvDAAO M104L.Таким образом, эффект стабилизации, по-видимому, обусловлен природойвводимых ароматических аминокислотных замен Phe, Tyr и Trp играет ключевуюроль. Как было отмечено в главе 4.1, на входе в активный центр TvDAAOрасполагаются два остатка Phe54 и Phe258, роль которых была изучена нами ранее[56,57]. Поскольку эти остатки находятся в непосредственной близости от остаткаMet104, то усиление взаимодействия между элементами вторичной структуры врезультате введения замен M104F, M104Y и M104W может быть причинойувеличения температурной стабильности TvDAAO.
Для проверки данной гипотезынами было решено изучить взаимодействия между остатками в 54, 104 и 258положениях с помощью направленного мутагенеза.1374.2.1. Компьютерное моделирование замен в 54, 104 и 258 положенияхОстаток Met104 находится на расстоянии около 4,5Å от остатков Phe54 иPhe258 (рис.
4.30A). В результате экспериментов in silico было показано, чтовведение замены M104F приводит к уменьшению указанных расстояний отостатков Phe54 и Phe258 до 3,5 и 3,7 Å, соответственного (рис. 4.30Б). Кроме того,в компьютерной модели активного центра TvDAAO M104F остаток Phe54располагается по отношению к остатку Phe104 в энергетически выгоднойконформации “Edge-to-Face”, а в свою очередь остатки Phe104 и Phe258располагаютсяотносительноконформации.Такимдругобразом,другарезультатытакжеввыгоднойкомпьютерного“T-shaped”моделированиясвидетельствуют о возможном образовании стабильного тримера из трехбензольных колец за счет π-π взаимодействий электронных оболочек боковыхрадикалов остатков Phe54, Phe104 и Phe258 в структуре TvDAAO M104F [171].Стоит отметить, что π-π взаимодействия широко распространены в структурнойбиологии.
Наиболее известной разновидностью является стэкинг-взаимодействиямежду азотистыми основаниями в структуре ДНК [172–175]. В большинстветрехмерных структур белков и ферментов также встречаются различные видыароматических π-π и катионных π+-π взаимодействий между аминокислотнымиостатками Phe, Tyr, Trp, His, Lys и Arg, которые, наряду с гидрофобнымивзаимодействиями, водородными связями и ионными парами, играют важную ролькак для поддержания стабильной четвертичной структуры белка, так и длямолекулярного узнавания [171,176–186]. В структуре TvDAAO также можновыделить несколько участков, где наблюдаются такого рода взаимодействия междуследующими остатками: 1 – Arg89, His91, His132, Phe225, Phe229, Arg282 и Phe283,2 – изоаллоксазиновый цикл FAD, Tyr243, Phe258, Arg302, 3 – Phe197, Phe200,Trp263, His301, 4 – His147, Arg247 Phe248, 5 – Trp51, Tyr68, Trp113, Phe114,Phe121, Phe141, 6 – Arg110 и Tyr137, 7 – Arg305, Arg310, His324, Tyr326, 8 –Tyr151, Trp154, Tyr333, Tyr337.138A1A2A3Б1Б2Б3В1В2В3Г1Г2Г3Рис.
4.30. Компьютерное моделирование замен M104F, F54S/M104F и M104F/F258S вструктуре TvDAAO. Активный центр TvDAAO дикого типа (А),TvDAAO M104F (Б), TvDAAO F54S/M104F (B), TvDAAO M104F/F258S (Г). 1 –вид спереди на активный центр, 2 – вид из активного центр, 3 – вид спереди,голубым цветом показана поверхность доступная растворителю.139Ранее в нашей лаборатории, в ходе работ по направленному повышениюкаталитическойактивностисцефалоспорином С,былиполученыиохарактеризованы мутантные TvDAAO заменами F54A, F54S, F54Y, F258A, F258S,F258Y [56,57]. Для изучения взаимодействия между остатками в 54, 104 и 258положениях было решено объединить замены F54S и F258S с заменами M104F,M104Y и M104W, что должно исключить любые взаимодействия, в том числегидрофобные, между парами остатков 54/104 и 104/258.
В качестве примера нарис. 4.30 В-Г приведены результаты компьютерного моделирования структурмутантных TvDAAO c двойными аминокислотными заменами F54S/M104F иM104F/F258S. В первом случае пропадает взаимодействие между остатками Phe104и Phe54, однако может сохраняться взаимодействие Phe104 с остатком Phe258.Активный центр становится немного более доступным растворителю.
Во второмслучае наоборот пропадает взаимодействие между остатками Phe104 и Phe258, номожет сохраняться с остатком Phe54. Кроме того, заметно, что увеличивается входв активный центр.Таким образом, для изучения стабилизационного эффекта в случае заменM104F, M104Y и M104W и изучения взаимодействия вводимых остатков сблизкорасположенными остатками Phe54 и Phe258 было решено получитьмутантные TvDAAO с двойными аминокислотными заменами F54S/M104S,F54S/M104F,F54S/M104Y,F54S/M104W,M104F/F258S,M104Y/F258S,M104W/F258S.4.2.2. Получение мутантных TvDAAO с двойными заменами в 54/104 и 104/258положенияхМутантные TvDAAO F54S и F258S были получены и охарактеризованы вработах [56,57] полностью согласно главе 4.1.
Олигонуклеотидные праймеры, длявведения соответствующих мутаций в ген tvdaao, представлены в таблице 4.13.Расположение мутаций, которые соответствуют заменам в 54, 104 и 258положениях, и сайтов рестрикции уникальных рестриктаз NcoI, EcoRI, Bsp119I иXhoI позволило получить мутантные гены tvdaao с двойными заменами с помощью140переклонирования участков генов, которые содержат триплеты, обеспечивающиезамены F54S, M104F, M104Y, M104W и F258S.Таблица 4.13.Олигонуклеотидные праймеры для введения мутаций в ген tvdaao в положения,соответствующие 54 и 258 остаткам в структуре TvDAAO.ЗаменаНуклеотидная последовательность*Mfor5’– CC AAC TGG CTC ACA TCT TAC GAT GGA GGC AAG TTAGCC –3’Mrev5’– CTT GCC TCC ATC GTA AGA TGT GAG CCA GTT GGC ACCT –3’Mfor5’– GGC GGT TGT TCT CAA CCC AAC AAC TGG TCA TC –3’Mrev5’– GTT GTT GGG TTG AGA ACA ACC GCC AAT GAT AGA AGTAC –3’F54SF258S* Полужирным шрифтом выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутации.Объединение замен F54S, M104F, M104Y, M104W было проведено спомощью рестрикции участка гена, который несет мутации, соответствующиезамене F54S, рестриктазами NcoI и EcoRI и последующим лигированием в вектора,которые имеют соответствующие замены M104F, M104Y, M104W.
Объединениезамен M104F, M104Y, M104W и F258S было проведено с помощью рестрикцииучасткагена,которыйнесетмутации,соответствующиезаменеF258S,рестриктазами Bsp119I и XhoI и последующим лигированием в вектора, которыеимеют соответствующие замены M104F, M104Y, M104W. Наличие тольконеобходимых мутаций было подтверждено с помощью секвенирования.Получение штаммов-продуцентов мутантных TvDAAO, культивирование,экспрессию, выделение и очистку проводили аналогично методикам, описанным вглаве 4.1 и разделе “Материалы и Методы”. В процессе культивирования всемутантныеTvDAAO F54S/M104S,F54S/M104F,F54S/M104Y,F54S/M104W,M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S синтезировались в активной ирастворимой форме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
