Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Более темный фон соответствует большему эффекту.157Таблица 4.20.Аддитивность свойств мутантных TvDAAO при различных температурах.Температура, отношение (αэксп/αтеор)*100%Форма TvDAAO Стадия50525456581686370F54S/M104F2446867137335079F54S/M104Y266545140126315152F54S/M104W210479596215667F54S/M104S28741199M104F/F258S226211241226M104Y/F258S2483129148381726M104W/F258S295886245Сравнение значений констант скоростей инактивации для мутантныхTvDAAOсдвойнымизаменамиF54S/M104S,F54S/M104F,F54S/M104Y,F54S/M104W и их точечных предшественников F54S, M104F, M104Y и M104Wпоказывает, что как по первой, так и по второй стадии наблюдается аддитивностьниже 100%, что говорит о взаимном влиянии замен, вводимых в 54 и 104 положения(табл.
4.20). Стоит отметить, что в случае объединения замен F54S и M104Fаддитивность по обеим стадиям термоинактивации в целом выше, чем в случаеобъединения замен F54S, M104Y, M104W и M104S. Это говорит о том, что введениезамены F54S в дополнение к заменам в 104м положении дестабилизирует точечныймутант TvDAAO M104F в меньшей степени, чем мутанты TvDAAO M104Y иM104W, причем эффекты дестабилизации при объединении M104Y и M104W сF54S близки между собой.
Данный вывод также следует из данных таблиц 4.18 и4.19 и температурных зависимостей констант скоростей k1 и k2 для первой и второйстадий термоинактивации, соответственно (рис. 4.39). Для констант скоростей напервой стадии термоинактивации температурные зависимости для двойныхмутантов с заменами F54S/M104F, F54S/M104Y и F54S/M104W по углу наклонаблизки к таковым для точечных мутантов с заменами M104F, M104Y, M104W иферменту дикого типа (рис. 4.39А). Однако стоит отметить, что для TvDAAO158F54S/M104F и TvDAAO F54S/M104W наблюдается некоторое увеличение угланаклона данных зависимостей, что, по-видимому, является результатом влияниязамены F54S, поскольку для этого фермента константа скорости k1 сильнее всегозависит от температуры. Как видно из рис.4.39А, все мутантные ферменты, кромеTvDAAO F54S/M104W, стабильнее фермента дикого типа на первой стадииинактивации при всех изученных температурах.
Для TvDAAO F54S/M104Wнаблюдается небольшая дестабилизация относительно фермента дикого типа. Болеесложная картина наблюдается для температурных зависимостей константы скоростиинактивации на второй стадии (рис.4.39Б). Мутантные TvDAAO F54S/M104F иTvDAAO F54S/M104W имеют похожие зависимости со своими точечнымипредшественниками в 104м положении. В случае TvDAAO F54S/M104Y уголнаклона зависимости k2 несколько меньше, чем для TvDAAO M10Y, что являетсярезультатом введения замены F54S, поскольку для TvDAAO F54S константа k2слабеезависитоттемпературы.Несмотрянаразличныетемпературныезависимости, мутантные TvDAAO F54S/M104F и TvDAAO F54S/M104Y на второйстадии термоинактивации оказываются стабильнее, чем мутантная TvDAAO F54S ифермент дикого типа, в то время как, мутантная TvDAAO F54S/M104W в пределахошибки эксперимента близка к своим точечным предшественникам.Такимобразом,посвоейтемпературнойстабильностимутантныеTvDAAO F54S/M104F и TvDAAO F54S/M104Y в изученных температурныхдиапазонах превосходят точечный мутант с заменой F54S и фермент дикого типа,однако уступают своим предшественникам с заменами M104F и M104Y.Температурная стабильность TvDAAO F54S/M104W в целом оказывается ниже,чем у фермента дикого типа и точечного предшественника TvDAAO M104W вовсем температурном диапазоне от 48 до 58°С, но при температурах выше 56°Сфермент немного стабильнее, чем TvDAAO F54S.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что взаимодействие вводимых ароматических замен в 104е положении с остатком Phe54 не является единственной причиной стабилизацииTvDAAO. Также интересным является тот факт, что объединение замен F54S иM104S в двойной мутант F54S/M104S приводит к сильному снижению темпера159турной стабильности TvDAAO, несмотря на то, что каждая из указанных точечныхзамен не дает такого эффекта дестабилизации.
По-видимому, при введенииточечных замен F54S или M104S в каждом случае сохраняются взаимодействиямежду остатками Met104-Phe258 или Phe54-Phe258, соответственно. Однаковозможно, что активный центр не так сильно экспонируется растворителю, как вслучае объединения точечных замен в двойной мутант.Анализ параметров термоинактивации для мутантных TvDAAO с двойнымизаменами M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S и их точечных предшественников M104F, M104Y, M104W, F258S показывает, что по обеим стадиям термоинактивации в среднем наблюдается очень низкая аддитивность, особенно в случаеобъединения замен M104F и F258S, что также указывает на взаимодействие междуостатками в 104 и 258 положениях (табл. 4.20).
Стоит отметить, что аддитивностьпри объединении замен в 104 и 258 положениях в целом ниже, чем при объединении замен в 54 и 104 положениях. Интересно, что введение замены F258S в дополнение к заменам в 104м положении дестабилизирует точечные мутантные TvDAAOM104F, TvDAAO M104Y, M104W в одинаково большой степени так, что двойныемутанты TvDAAO M104F/F258S, M104Y/F258S, M104W/F258S по стабильностистановятся сравнимы с исходной TvDAAO F258S (таблицы 4.18, 4.19 и рис. 4.38).Об этом также говорят температурные зависимости для констант первой и второйстадий термоинактивации (рис.
4.40). На первой стадии инактивации наклоны этихзависимостей для TvDAAO M104F/F258S и M104W/F258S близки к таковым длясоответствующих точечных мутантов с заменами M104F и M104W и ферментадикого типа. В случае TvDAAO M104Y/F258S значения k1 в меньшей степенизависят от температуры, в отличие от остальных двойных мутантов в этихположениях и температурная зависимость оказывается похожей как на TvDAAOF258S, так и на TvDAAO M104Y. Интересным является тот факт, что двойныемутанты TvDAAO M104F/F258S, M104Y/F258S и M104W/F258S оказываютсяменее стабильными на первой стадии инактивации, чем TvDAAO F258S притемпературах выше 52°С (рис.
4.40А). На второй стадии наблюдается несколькодругая ситуация. По своим температурным зависимостям k2 двойные мутанты160TvDAAO M104F/F258S, TvDAAO M104Y/F258S, TvDAAO M104W/F258S являютсячем-то среднем между точечными предшественниками M104F, M104Y, M104W иF258S соответственно. Другими словами, замены в 104и и 258м положенияхприблизительно в равной степени влияют на вид температурной зависимости k2 длядвойных мутантов. Однако значения констант скоростей первой и второй стадийтермоинактивации лежат выше соответствующих значений для фермента дикоготипа. В результате в сумме по обеим стадиям термоинактивации двойные мутантыTvDAAOM104F/F258S, M104Y/F258S и M104W/F258S оказываются менеестабильны, чем TvDAAO дикого типа во всем изученном температурном диапазонеот 46 до 56°С.
Анализ данных таблиц 4.18, 4.19 и рис. 4.40 позволяет сделать вывод,что несмотря на сильную дестабилизацию в случае двойных замен 104/258, всовокупности по обеим стадиям термоинактивации наиболее стабильным являетсямутант TvDAAO M104F/F258S. В силу сложного механизма термоинактивации иразличныхтемпературныхзависимостейk1иk2,стабильностиTvDAAOM104Y/F258S и TvDAAO M104W/F258S при каждой температуре определяютсясоотношениемконстантTvDAAO M104Y/F258Sкаждойстадииоказываютсяинактивации,немногоменееновцеломстабильнее,чемTvDAAO M104W/F258S.Таким образом, наблюдается сильная дестабилизация TvDAAO M104F/F258S,TvDAAO M104Y/F258S, TvDAAO M104W/F258S относительно точечных мутантовс заменами M104F, M104Y, M104W и фермента дикого типа за счет введениязамены F258S.
Исходя из этого, можно сделать вывод о наличии взаимодействиямежду ароматическими заменами в 104м положении и остатком Phe258. Причем,как следует из полученных данных, данное взаимодействие вносит основной вклад встабилизацию TvDAAO, особенно в случае замены M104F. Для всех двойныхмутантов, исходя из температурных зависимостей констант скорости (рис.4.39,4.40), были найдены активационные параметры – энтальпия и энтропия активации, атакжеАррениусовскаяэнергияактивациидляпервойивторойстадийтермоинактивации (табл. 4.21). Значения H#, S# и Ea соотносятся с положениемтемпературных зависимостей и по сути являются их численным представлением.161wt-TvDAAOTvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAOM104WTvDAAO F54STvDAAO F54S/M104FTvDAAO F54S/M104YTvDAAO F54S/M104W-11ln(k1/T)-12-13-14-15-160,002950,003000,00305-11/T, KА0,00315wt-TvDAAOTvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104WTvDAAO F54STvDAAO F54S/M104FTvDAAO F54S/M104YTvDAAO F54S/M104W-11-12ln(k2/T)0,00310-13-14-15-160,002950,003000,00305-11/T, KБ0,003100,00315Рис.
4.39. Температурные зависимости констант скорости первой (k1/T от 1/T, А) и второй(k2/T от 1/T, Б) стадий термоинактивации для мутантных TvDAAO с заменамиF54S ( ,─), M104F (▲,─), M104Y (●,─), M104W (♦,─), F54S/M104F ( ,─ ─),F54S/M104Y ( ,─ ─), F54S/M104W ( ,─ ─) и TvDAAO дикого типа (■,─).Концентрация ферментов 10 мкг/мл, 0,1 М КФБ, рН 8,0.162wt-TvDAAOTvDAAO F258STvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104WTvDAAO M104F/F258STvDAAO M104Y/F258STvDAAO M104W/F258S-11ln(k1/T)-12-13-14-15-160,002950,003000,00305-11/T, KА0,00310wt-TvDAAOTvDAAO F258STvDAAO M104FTvDAAO M104YTvDAAO M104WTvDAAO M104F/F258STvDAAO M104Y/F258STvDAAO M104W/F258S-11-12ln(k2/T)0,00315-13-14-15-160,002950,003000,00305-11/T, KБ0,003100,00315Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
