Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна (1105750), страница 28
Текст из файла (страница 28)
В структуре169TvDAAO боковой радикал данного остатка образует водородные связи с 3’-оксигруппой рибозы FAD, а также с атомами полипептидной цепи остатков Ala9 иPhe33. На наш взгляд направленный мутагенез этого остатка не являетсяцелесообразным.Остатки Glu32 и Phe33 не являются консервативными, располагаются вблизимежсубъединичного контакта в димере TvDAAO на поверхности белковойглобулы, однако их боковые радикалы не принимают участия в каких-либомежсубъединичных взаимодействиях.
Атомы полипептидной цепи остатков Glu32и Phe33 образуют водородные связи с аденином и окси-группами рибозы FADсоответственно. Поскольку гидрофобный боковой радикал Phe33 находится внепосредственной близости от гидрофильных окси-групп рибозы, то такоевзаимодействие может быть неоптимальным. У других DAAO в положениях,которые соответствуют остатку Glu32 в последовательности TvDAAO, наиболеечасто встречаются остатки Asp, Lys, Ala, Glu, Arg, His и др.
В случае остатка Phe33наиболее часто встречаются Arg, His, Ala, Asp, Glu и др. (рис. 2.2). У RgDAAO вположениях, которые эквивалентны по выравниванию 32 и 33 позициям вTvDAAO, находятся остатки Arg и Asp соответственно.Остатки Thr43 и Ser44 располагаются рядом с фосфатными группами FAD.На месте остатка Thr43 в большинстве последовательностей DAAO находитсяразрыв, а в наиболее близких по гомологии структурах встречается также остатокThr.
У RgDAAO в соответствующем положении находится Ala, введение котороговструктуруTvDAAOнеприведетквозникновениюдополнительныхвзаимодействий с молекулой FAD. Кроме того, данный остаток своим боковымрадикалом образует водородную связь с карбонильной группой остатка Arg302.Остаток Ser44 своим боковым радикалом образует водородные связи сфосфатными группами FAD и является полуконсервативным – помимо Ser вданном положении встречаются только 5 остатков Thr и 5 остатков Gly. УRgDAAO этому остатку также соответсвует остаток Ser.
Кроме того, Thr43 и Ser44находятся внутри белковой глобулы в близком контакте со своим окружением.Исходя из этого, замена этих двух остатков представляется нецелесообразной.170Остаток Val171 образует водородные связи атомами полипептидной цепи садениновой частью FAD. Боковой радикал Val171 находится внутри белковойглобулы в гидрофобном ядре, которое образовано остатками Ile7, Val30, Ile174,Ala177, Leu180 и Ile190.
У RgDAAO в соответствующем положении такженаходится остаток Val. Таким образом, замена данного остатка может привести кпотере гидрофобных взаимодействий и нарушению структуры фермента в областисвязывания адениновой части FAD, что в конечном счете может отрицательносказаться температурной стабильности TvDAAO. Поэтому Val171 был исключен извозможных кандидатов для направленного мутагенеза.Таким образом, на основе анализа структуры FAD связывающего доменаTvDAAO, а также исходя из выравнивания аминокислотных последовательностейDAAO из различных источников, нами были отобраны остатки Ala9, Ala12, Glu32и Phe33 для проведения направленного мутагенеза.
Выбор аминокислотных заменв первую очередь был основан на сравнении первичных и четвертичных структурTvDAAO и RgDAAO. На рис. 4.42 представлен результат наложения структурRgDAAO и TvDAAO друг на друга в области кофермент-связывающего домена.Нумерация остатков приведена для последовательности TvDAAO. На основесравнения структур TvDAAO и RgDAAO были выбраны замены A9S и A12I.Результаты компьютерного моделирования для этих замен представлены нарис.
4.43. Видно, что в модельной структуре мутантной TvDAAO A9S сохраняютсяводородные связи, изначально существующие в ферменте дикого типа, но при этомбоковой радикал вводимого остатка Ser может образовать новые водородные связис остатками Ser31, Tyr42, Phe33 и 3’-оксигруппой рибозы (рис.
4.43А). Исходя изэтого, также была выбрана замена A9T. При введении замены A12I происходитзаполнение полости, которая была описана выше (рис. 4.43Б). С целью заполненияполости также была выбрана замена A12M. Кроме того, была выбрана заменаA12S, поскольку в соответствующем положении встречаются остатки Ser унаиболее гомологичных DAAO и введение такой замены может приводить кобразованию водородных связей с остатком фосфатной группой FAD.171Рис. 4.42. Наложение структуры RgDAAO (1C0P, остатки показаны темно-желтымцветом) на структуру TvDAAO (остатки показаны темно-зеленым цветом) вобласти FAD-связывающего домена, RMSD = 1,27Å.
Нумерация остатковприведена для TvDAAO.Эксперименты по компьютерному моделированию показали, что в структуреRgDAAO остаток Arg35 (соответствует Glu32 у TvDAAO) образует катионное π+-πвзаимодействие с ароматическим ядром аденина (рис. 4.42). Как упоминалось вглаве 4.2такогородавзаимодействия,нарядусдругимислабымивзаимодействиями в белках, играют важную роль в поддержании стабильнойчетвертичной структуры [171,176–186,191]. В структуре TvDAAO есть несколькоучастков, где наблюдаются различные π-π взаимодействия, в том числе катионныеπ+-π взаимодействия, например, между остатками Arg89 и Phe225, а также междуизоаллоксазиновым циклом FAD, Arg302 и Phe258 (рис.
4.41). Стоит отметить, чтопри катионном π+-π взаимодействии между Arg и ароматическими системами,гуанидиновая группа остатка Arg сохраняет способность образовывать водородныесвязи. Остаток Arg35 в структуре RgDAAO находится близко к поверхностифермента и, являясь конформационно подвижным, с большой вероятностью также172может образовывать водородные связи как с аденином FAD, так и с соседнимиаминокислотными остатками. Из рис.
4.42 хорошо видно, что остаток Asp36(соответствует Phe33 у TvDAAO) образует водородную связь с 2’-окси-группойрибозы. Таким образом, на основании вышесказанного нами были выбраны заменыE32R и F33D. Стоит отметить, что замена F33D приводит к появлениюдополнительного отрицательного заряда в области связывания FAD. Поскольку вTvDAAO дикого типа в 32м положении находится остаток Glu, то введение заменыF33D приведет к возникновению двух отрицательно заряженных остатков всоседних положениях, что в результате может привести к дестабилизации белковойглобулы.
В связи с этим, для предотвращения отталкивания указанныхотрицательно заряженных остатков нами было решено ввести двойную заменуE32R/F33D. Кроме того, поскольку в TvDAAO дикого типа в этой области имеетсяодин отрицательный заряд, то для его сохранения в дополнение к замене F33Dбыла предложена замена E32Q, исходя из структурного сходства остатков Glu иGln. В качестве примера на рис. 4.44 представлена компьютерная модельTvDAAO E32R/F33D в сравнении с ферментом дикого типа. Видно, что заменаE32R/F33DвFAD-связывающемдоменеTvDAAOхорошоимитируетсоответствующий участок последовательности RgDAAO. В результате заменыE32R/F33Dнетолькосохраняютсявсеводородныесвязи,изначальносуществующие в ферменте дикого типа, но и образуются новые, причем можетвозникать катионное π+-π взаимодействие между вводимым остатком Arg в 32положение и адениновой частью FAD.
Кроме того, в результате такой замены FADстановится менее экспонирован растворителю, чем в случае TvDAAO дикого типа,что может также оказать положительное влияние на температурную стабильностьфермента(рис. 4.44).Забегаявперед,отметим,чтопорезультатампредварительных экспериментов двойная замена E32R/F33D оказалась наиболееудачной с точки зрения температурной стабильности, поэтому нами было решенопровести подробное изучение отдельных остатков 32 и 33 положения.173А1А2Б1Б2Рис. 4.43.
Компьютерное моделирование замены A9S и A12I в структуре TvDAAO.Область FAD-связывающего домена TvDAAO дикого типа (А1, Б1),TvDAAO A9S (А2) и TvDAAO A12I (Б2). Новые водородные связи показанысиним пунктиром, а совпадающие – красным.Для изучения влияния введения отдельных замен в эти положения насвойства TvDAAO, на основе множественного выравнивания и компьютерногомоделирования были предложены замены E32Q, E32R, F33D, F33H, F33S и F33T,каждая из которых также способна образовывать водородные связи как с аденином,так и с 2’-окси-группой рибозы FAD.Итак, в результате комплексного анализа FAD-связывающего доменаTvDAAO для введения в структуру фермента с помощью направленногомутагенеза были выбраны следующие 11 точечных и 2 двойные замены:A9S, A9T, A12S, A12I, A12M, E32Q, E32R, F33D, F33H, F33S, F33T, E32Q/F33D,E32R/F33D.174A1A2Б1Б2Рис.
4.44. Компьютерное моделирование двойной замены E32R/F33D в структуреTvDAAO. Область FAD-связывающего домена TvDAAO дикого типа (А) иTvDAAO E32R/F33D (Б). 1 – новые водородные связи показаны синимпунктиром, совпадающие – красным. Оранжевым пунктиром показанокатионное π-взаимодействие между заменой E32R и адениновой частью FAD, 2– голубым цветом показана поверхность доступная растворителю.1754.3.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами в 9, 12, 32 и 33 положенияхПолучение мутантных TvDAAO с заменами A9S, A9T, A12S, A12I, A12M,E32Q, E32R, F33D, F33H, F33S, F33T, E32Q/F33D, E32R/F33D проводили согласноэкспериментам, описанным в главе 4.1. Олигонуклеотидные праймеры длянаправленного мутагенеза гена tvdaao в положениях, которые соответствуютостаткам Ala9, Ala12, Glu32 и Phe33, представлены в таблице 4.22.
Для проведенияреакции рестрикции были использованы рестриктазы NcoI и EcoRI. Результатысеквенирования полученных плазмид показали наличие только необходимыхмутаций в гене tvdaao. Получение штаммов-продуцентов мутантных TvDAAO,культивирование, экспрессию, выделение и очистку проводили аналогичнопредыдущим главам. Результаты культивирования и экспрессии мутантныхTvDAAO представлены в таблице 4.23. При культивировании всех мутантоввыходы биомассы сравнимы или выше, чем в случае фермента дикого типа.Исключением является только TvDAAO E32R. Для этого фермента количествобиомассы ниже, чем для остальных, что связано с ранним лизисом клеток прикультивировании. Все мутантные ферменты синтезировались в активной ирастворимой форме, за исключением мутанта TvDAAO с заменой F33D, которыйбыл активен только в осадке клеточных стенок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
