Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 23
Текст из файла (страница 23)
II.32. Кривые клеточного роста B. subtilis PY79 (WT, зеленая) и мутантных клеточныхлиний ΔbsrA (голубая), ΔbsrB (фиолетовая), ΔbsrAB (черная), ΔbsrAB+A (красная) иΔbsrAB+B (желтая).Отметим, что делеция гена bsrA не приводила к существенным изменениям вскорости роста клеток, описанным в работах [4, 64]. По всей видимости, как 6S-1, так и6S-2 РНК B. subtilis, не являются критически необходимыми для жизни клеток прикультивировании в богатых питательных средах, и поведение той или иной мутантнойклеточной линии сильно зависит от конкретных условий проведения эксперимента.Нельзя исключить и существования различий в поведении при культивировании клетокштамма B. subtilis 168 (использовавшихся в работах [4, 64]) и B.
subtilis PY79.Исходя из полученных результатов для клеточной линии B. subtilis PY79 и еёмутантных производных можно предположить, что 6S-1 и 6S-2 РНК являютсявзаимозаменяемыми и при отсутствии одной нкРНК, вторая нкРНК выполняет функцию106ингибитора транскрипции. Только в отсутствие обеих 6S РНК в условиях недостаткапитательных веществ неконтролируемая транскрипция генов приводит к негативнымпоследствиям для клетки.
Однако с учетом различий, обнаруженных в процессе синтезапРНК6S-1 и пРНК6S-2 (раздел II.5), эта гипотеза требует дополнительных подтверждений.II.6.2. Синтезируются ли пРНК in vivo?В ходе совместной работы с немецкими коллегами (лабораторией проф.Р. Хартманна) был проведен анализ общей РНК, выделенной из клеток B. subtilis штамма168 на различных стадиях клеточного роста, и секвенированы фрагменты РНК длинойменее 50 н.о. Было обнаружено, что максимальное количество считываний области 6S-1РНК, комплементарной пРНК6S-1, происходит на стадии выхода клеток из стационарнойфазы при разбавлении клеточной культуры свежей питательной средой.
По сравнению состационарной фазой эффективность транскрипции in vivo коротких пРНК6S-1 (длиной 8-13н.о.) возрастает в ~ 10 раз, а длинных пРНК6S-1 (14 н.о.) – более чем в 50 раз [153]. Этотфакт свидетельствует об активном функционировании 6S-1 РНК in vivo в соответствии смеханизмами, наблюдаемыми в условиях in vitro. Статистически значимого количествасчитываний области 6S-2 РНК, комплементарной пРНК6S-2, обнаружено не было.Возможнымиобъяснениямиэтогофактамогутслужитьбыстраядеградациясинтезирующихся in vivo пРНК6S-2 или низкая эффективность их синтеза в исследуемыхусловиях роста клеток.
Кроме того, высокое содержание остатков А в природной пРНК6S-2может привести к потере части сигналов, поскольку одной из стадий получения библиотеккДНК для последующего секвенирования является полиаденилирование общей РНК.Альтернативным методом детекции пРНК in vivo является блот-гибридизация общейРНК, выделенной из клеток B. subtilis на различных стадиях клеточного роста, соспецифичнымизондами–комплементарнымиолигодезоксирибонуклеотидами,содержащими остатки ковалентно замкнутых нуклеозидов (см. раздел II.5).
Продуктыгибридизации можно детектировать методом авторадиографии при использовании5'-[32Р]-меченного зонда или с помощью иммуноферментного анализа при использованиизонда, содержащего остаток дигоксигенина (DIG). DIG-антитела ковалентно связаны сщелочной фосфатазой и в процессе детекции дефосфорилируют коммерческий реагентCDP-star, в результате чего происходит разгорание люминесценции (λ = 465 нм).Мы сравниличувствительностьдвухметодовдетекциивконтрольномэксперименте (рис. II.33). Для этого различные количества синтетических пРНК6S-2длиной 15 и 20 н.о. иммобилизовали на нейлоновой мембране с помощьюN-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодимидгидрохлорида,изатемпроводили107гибридизацию при 68°С с тем или другим зондом (см.
главу «Экспериментальная часть»).Оба зонда содержали идентичную 12-звенную нуклеотидную последовательность свключениями 4 остатков ковалентно замкнутых нуклеозидов, но 5'-[32Р]-меченный зондсодержал еще 3 дополнительных н.о. на 5'-конце для более прочной гибридизации. Наосновании полученных результатов можно утверждать, что основанный на детекциихемилюминесценцииметодявляетсяболеечувствительнымпосравнениюсиспользованием радиоактивного зонда и позволяет обнаружить гораздо меньшиеколичества пРНК вплоть до 0,01 нг.Рис.
II.33. Анализ чувствительности метода блот-гибридизации синтетическихолигорибонуклеотидов – аналогов пРНК6S-1 и пРНК6S-2 – с DIG-меченным (300 пмоль намембрану) и [32P]-меченным (10 мкКи на мембрану) зондами к пРНК6S-2. Некомплементарныйолигорибонуклеотид (р146S-1) выделен серым цветом. Последовательности зондов, используемыхдля гибридизации, указаны справа. Остатки ковалентно замкнутых нуклеозидов (LNA) выделеныжирным курсивом и подчеркнуты.
DIG остаток дигоксигенина. Время экспозиции сигналовхемилюминесценции – 5 мин, радиоактивности – 6 ч.На следующем этапе были проанализированы общие РНК, выделенные из клетокB. subtilis PY79 на различных стадиях клеточного роста. Для этого клеточные линиикультивировали в богатой питательной среде в течение 48 ч, отбирая аликвоты длявыделения общей РНК через 3, 4,5, 6, 10, 24, 36 и 48 ч после инокуляции (рис. II.34А).Кроме того, для моделирования условий выхода из стационарной фазы аликвотуклеточной культуры, отобранную после 24 ч выращивания, разбавляли в соотношении 1:5свежей питательной средой и инкубировали в течение 5 мин, а затем проводиливыделение общей РНК (рис.
II.34А, точка z). Для сравнения также использовали общуюРНК, выделенную из клеток B. subtilis 168.В первую очередь проводили блот-гибридизацию выделенной общей РНК с зондамик 6S-1 и 6S-2 РНК для контроля их экспрессии (рис. II.34Б), а также с зондом к 5S РНК вкачестве РНК сравнения. Профили экспрессии обеих 6S РНК в штаммах B. subtilis 168 иPY79 немного отличаются, но общая тенденция изменения концентраций этих нкРНКсохраняется.108Рис.
II.34. Анализ профилей экспрессии 6S-1 и 6S-2 РНК в клетках B. subtilis 168 иB. Subtilis PY79. (А) Кривые клеточного роста B. subtilis 168 и B. subtilis PY79. Черными точками ибуквами (a-g) отмечено время отбора аликвот клеточной культуры для выделения общей РНК: 3,4,5, 6, 10, 24, 36 и 48 ч, соответственно. Буквой z в круге отмечена аликвота клеточной культуры,использовавшаяся для моделирования стадии выхода из стационарной фазы роста клеток.(Б) Результаты блот-гибридизации общей РНК (3 мкг), выделенной на различных стадиях ростаB. subtilis с зондами к 6S-1, 6S-2 и 5S РНК. Положительные контроли – 6S-1 РНК (2 нг) или6S-2 РНК (10 нг в случае B. subtilis 168 и 2 нг в случае B.
subtilis PY79). (В) Диаграммы измененияуровней экспрессии 6S-1 и 6S-2 РНК в клетках B. subtilis 168 и B. subtilis PY79 (нормированные поконцентрации 5S РНК) в промежутки времени, соответствующие точкам отбора клеточнойкультуры. За единицу принимали минимальную концентрацию 6S РНК (в точке а для 6S-1 РНК ив точке g для 6S-2 РНК).Cинтез 6S-1 РНК в обоих случаях аккумулируется в поздней экспоненциальной ранней стационарной фазах роста клеток.
После 24 ч культивации клеток зафиксированасильная деградация 6S-1 РНК (до 50%), затрудняющая оценку суммарного количестваэтой РНК, однако уровень полноразмерной 6S-1 РНК в среднем остается постоянным илидаже немного возрастает. Напомним, что в клетках B. subtilis экспрессируются дваварианта 6S-1 РНК – зрелая 6S-1 РНК длиной 190 н.о.
и её предшественник длиной201 н.о. (см. раздел I.2.3.2 в главе «Обзор литературы»), поэтому при блот-гибридизации109детектируютсядвеполосы.Максимальнаяконцентрация6S-2 РНК,наоборот,наблюдается в средней экспоненциальной фазе роста клеток, а затем снижается в~ 47 раз при переходе в позднюю стационарную фазу (рис. II.34В). Как в случаеB. subtilis 168, так и B. subtilis PY79 при увеличении содержания питательных веществ вкультуральной среде и выходе клеток из стационарной фазы вновь наблюдаетсяповышение уровня 6S-2 РНК (рис. II.34Б, В, точки z). Сигналов деградации 6S-2 РНКзафиксировано не было. Отметим, что представленные диаграммы (рис.
II.34В) отражаюттолько степень изменения отдельно рассматриваемых уровней экспрессии каждой из 6SРНК, и не применимы для количественной оценки содержания в клетке этих нкРНКотносительно друг друга.Те же образцы общей РНК, выделенной из клеток B. subtilis 168 и PY79, былипроанализированыметодомблот-гибридизациисзондамикпРНК6S-1ипРНК6S-2 (рис. II.35).Рис. II.35. Результаты блот-гибридизации общей РНК (10 мкг), выделенной на различныхстадиях роста клеток B.
subtilis 168 (А) и B. subtilis PY79 (Б) с зондами к пРНК6S-1 и пРНК6S-2.В качестве положительных контролей использовали синтетические пРНК6S-1 и пРНК6S-2 длиной 14и 15 н.о., соответственно (p146S-1 и p156S-2, 0,5 нг). Буквами (a-g) отмечено время отбора аликвотклеточной культуры для выделения общей РНК: 3, 4,5, 6, 10, 24, 36 и 48 ч, соответственно, буквойz в круге отмечена аликвота клеточной культуры, использовавшаяся для моделирования стадиивыхода из стационарной фазы роста клеток (см. рис.
II.34).В случае 6S-1 РНК удалось детектировать слабые сигналы пРНК на протяжениипрактически всей стационарной фазы роста клеток B. subtilis как штамма 168, так иштамма PY79, а максимальная концентрация пРНК6S-1 в обоих случаях былазафиксирована на стадии выхода из стационарной фазы (рис. II.35, дорожки z).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
