Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Это ожидаемыйрезультат. 6S РНК-зависимое ингибирование лишь косвенно связано с уровнемэкстпрессии каждого конкретного гена, так как «мишенью» 6S РНК является РНКП.Присутствие на двумерном геле зон зеленого цвета (соответствующих белкам,эффективность синтеза которых увеличивалась в присутствии 6S РНК) может бытьобусловлено снижением уровня экспрессии генов, кодирующих транскрипционныерепрессоры или другие белки, вовлеченные в регуляторные процессы.Таблица II.3. Белки, идентифицированные методом масс-спектрометрии MALDI-TOF,экспрессия которых регулируется обеими 6S РНК.24БелокПредполагаемая функцияAhpC алкилгидропероксидредуктаза(малая субъединица)Восстановление H2O2 в условиях окислительногостресса клеткиKatA вегетативная каталазаРазложение H2O2 в условиях окислительного стрессаклеткиMdh малатдегидрогеназаОкисление малата в оксалоацетат (цикл Кребса)MntA Mn2+-связывающийлипопротеин, ABC-транспортер24Транспорт Mn2+ через клеточную мембрануRplJ белок L10 50S-субчастицырибосомыУчастие в клеточном ответе на холодовой шок ивысокую концентрацию соли, структурная функцияSufC АТРаза в составе клеточногоаппарата мобилизации серыГидролиз АТР, мобилизация железа и серы в условияхокислительного стресса клеткиTpiA триозофосфатизомеразаПревращение D-глицеральдегид-3-фосфата вдигидроксиацетонфосфат (гликолиз)YvyD ассоциированный с рибосомойбелок модуляции транскрипционногофактора σLИнгибирование синтеза σL в условияхаминокислотного голоданияСуперсемейство консервативных транспортных белков ABC (ATP-binding cassette).115Таблица II.4.
Белки, идентифицированные методом масс-спектрометрии MALDI-TOF,экспрессия которых регулируется только 6S-2 РНК.БелокПредполагаемая функцияAcoB ацетоиндегидрогеназаПревращение ацетоина в диметилглиоксальGapA глицеральдегидфосфатдегидрогеназаОкисление глицеральдегид-3-фосфата (гликолиз)PyrG CTP-синтетазаСинтез СТРПоскольку максимальная концентрация 6S-1 РНК приходится на раннююстационарную фазу, наиболее заметные изменения в протеоме ΔbsrА следовало ожидатьименно на этой стадии клеточного роста. Действительно, уровень экспрессии многихбелков в клетках ΔbsrА возрастал по сравнению с клетками дикого типа, однаконаблюдаемый эффект был слабее предполагаемого (рис. II.38А).
Частично это может бытьсвязано с глобальным уменьшением синтеза белков при переходе в стационарную фазуроста клеток и, как следствие, с меньшей интенсивностью сигналов флуоресценции.Рис. II.38. Сравнительный протеомный анализ белковых фракций, выделенных изклеточных линий B. subtilis дикого типа (PY79) и мутантных штаммов ΔbsrA (А) и ΔbsrB (Б) встационарной фазе роста клеток (А600 ~ 4 О.Е.). Зоны красного и зеленого цвета на двумерном гелесоответствуют белкам, уровень экспрессии которых, соответственно, увеличивается илиуменьшается, при делеции гена bsrA или bsrB. Идентифицированные с помощью массспектрометрии MALDI-TOF белки подписаны. Красным шрифтом выделены названия белков,экспрессия которых ингибируется обеими 6S РНК, белым – только одной из 6S РНК.Несмотря на то, что концентрация 6S-2 РНК в стационарной фазе роста клетокотносительно низка, делеция гена bsrB в данном случае также вызывает заметныеизменения с клеточном протеоме (рис.
II.38Б). Интересно, что экспрессия некоторыхбелков увеличивалась как в отсутствие 6S-1 РНК, так и в отсутствие 6S-2 РНК. Методоммасс-спектрометрии MALDI-TOF были идентифицированы два таких белка – Mdh и YvyD(табл. II.3). Некоторые белки эффективнее экспрессировались в отсутствие только1166S-1 РНК (AhpC, SufC, TpiA, MntA) или только 6S-2 РНК (KatA, GapA). В ходепротеомного анализа клеток ΔbsrАB по сравнению с клетками дикого типа наблюдали«суммарный» эффект делеций bsrA и bsbB, обусловленный одновременным возрастаниемэкспрессии белков, зависящей и от наличия в клетке как 6S-1, так и 6S-2 РНК (данные неприведены).Для исключения вероятности детекции «ложных» результатов, связанных свлиянием флуоресцентной группы было проведено так называемое «перекрестноемечение» образцов белков из сравниваемых клеточных линий.
Например, общуюбелковую фракцию из штамма ΔbsrB метили красителем Cy3, а из клеток дикого типа –Cy5. Изображение двумерного геля сравнивали с полученным ранее, где белки из клетокΔbsrB содержали краситель Cy5, а из клеток дикого типа – Cy3, и проводили соотнесениезон красного и зеленого цвета в обоих случаях. Характерные красные зоны,присутствующие на рис. II.39А, соответствовали зеленым зонам на рис. II.39Б, чтосвидетельствует о достоверности полученных результатов.Рис. II.39. «Перекрестное мечение» белков из клеточных линий B.
subtilis PY 79(WT)-Су3/ΔbsrB-Су5 (А) и B. subtilis PY 79 (WT)-Су5/ΔbsrB-Су3 (Б). Наиболее иллюстративныеобласти гелей увеличены.Таким образом, в результате сравнения общих протеомов штаммов ΔbsrA и ΔbsrВ иклеток дикого типа было установлено, что обе 6S РНК влияют на экспрессию геновв B. subtilis. Ингибирующее влияние 6S-1 РНК на биосинтез белков оказалось менеезаметным, возможно, из-за того, что при переходе в стационарную фазу экспрессия частибелков уменьшается в связи с отсутствием достаточного количества питательных веществ.Большее количество белков с измененным уровнем экспрессии было зафиксировано в117случае делеции гена bsrB, кодирующего 6S-2 РНК.
Обнаруженный факт представляетопределенный интерес. Если обе 6S РНК одинаково эффективно связывают РНКП(см. раздел II.3) и ингибирование экспрессии того или иного гена сводится лишь кконкуренции между 6S РНК и промотором ДНК за образование комплекса с ферментом,то остается неясным, как объяснить появление белков (например, AcoB, GapA и PyrG),экспрессия которых изменяется в отсутствие только 6S-2 РНК. Возможно, это связано сотличиями в механизмах действия 6S-1 и 6S-2 РНК, в том числе и с обнаруженными намиособенностями синтеза пРНК, описанными в разделе II.5. Анализируя функцииидентифицированных белков (табл. II.3 и 4), можно сказать, что большинство из нихучаствуют в процессах метаболизма и адаптации клетки к стрессовым условиям, то естьотсутствуют в клетке в «спокойном» состоянии.
Безусловно, отдельно взятые белки немогут однозначно охарактеризовать биологические функции 6S-1 РНК и 6S-2 РНК вклетке. Кроме того, уровень их экспрессии может изменяться в присутствии 6S РНК лишькосвенно – за счет ингибирования или активации синтеза факторов транскрипции илитрансляции белковой природы. Однако нами впервые установлена физиологическая роль6S-1 РНК и 6S-2 РНК B. subtilis как регуляторов экспрессии генов.118ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬIII.1.
Реактивы и материалыРеактивы: : агароза, агар, дрожжевой экстракт, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты(dNTP), N,N’-метиленбисакриламид, мочевина, этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА),перхлорат лития, додецилсульфат натрия (ДСН), трис-(гидроксиметил)аминометан (Трис),хлорид натрия, триптон, акриламид, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N′-2-этансульфоноваякислота(HEPES),ацетатнатрия(AcONa),персульфатаммония(APS),октилфенокполиэтоксиэтанол (Nonidet P-40), хлорид магния, карбонат натрия (Хеликон,Россия); рибонуклеозидтрифосфаты (ATP, CTP, UTP, GTP), пирофосфотаза, гуанозин(Thermo Fisher Scientific, США); лизин, ингибитор протеаз Protease Inhibitor Cocktail(Roche,Швейцария);спермидин,ампицилин,спектиномицин,хлорамфеникол,канамицин, изопропанол, фенол (Carl Roth GmbH, Германия); формалин, трифторуксуснаякислота (ТФУ), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, США); пентагидраттиосульфатанитратсеребраN,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамин(TEMED)гидрокарбонатнатрия,аммония(Panreac,Испания);(Merck,(Serva,имидазолГермания);Германия);глицерин,ацетонитрил,(AppliChem,Германия);[γ-32Р]-АTP, [γ-32Р]-GTP и [α-32Р]-NTP с удельной радиоактивностью 4000 Кюри/ммоль(ВО Изотоп, Россия); гепарин (Ферейн, Россия); амфолины 3–10 (BioRad, США);гидроксисукцинимидные эфиры флуоресцентных красителей Cy3 иCy5 (BioDye, Россия);ацетон(Химмед,Россия);CHAPS(3-[(3-холиламидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат) (Amresco, США); гексацианоферрат (II) калия (Реахим, Россия);Ni2+-NTA-агарозная суспензия (QIAGEN, Германия); декстроза (D-глюкоза) (SigmaAldrich, США); бромид этидия (EtBr) (Calbiochem-Behring Corporation, США); уксуснаякислота,трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан(1,4-дитиотреит,ДТТ)(Fluka,Швейцария); хлороформ, этиловый спирт (EtOH) (Merck, Германия); изоамиловый спирт(LifeTechnologies,США);маркеры-красителибромфеноловыйсиний(БФС)иксиленцианол (КЦ) (Reanal, Венгрия); белковый маркер: PageRuler Plus Prestained ProteinLadder, буферы для нанесения в гель: RNA Loading Dye, DNA Loading Dye, Orange DNALoading Dye, маркер РНК: RiboRuler™ RNA Ladder Low Range, маркеры ДНК:GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, США).
Остальные реактивы –коммерческие препараты отечественного производства.Ферменты и белки. Препарат Т7 РНКП (~ 40 ед. акт./мкл) был любезнопредоставлен проф. Р. Хартманном (Марбургский университет имени Филиппса,Германия). В работе также были использованы T4-полинуклеотидкиназа, Taq-полимераза,эндонуклеазы рестрикции EcoRI и HindIII (Thermo Fisher Scientific, США); лицозим119(Amresco, США); трипсин (Promega, США); рибонуклеаза А (РНКаза А) (Хеликон,Россия); нуклеаза I (ДНКаза I) (Roche, Швейцария).Клеточные линии B. subtilis 168, B.
subtilis PY79, нокаутные клеточные линииB. subtilis PY79 (brsA, brsB, brsAB, brsAB+A, brsA+B), а также клетки E. сoli DH5αбыли любезно предоставлены проф. Р. Хартманном (Марбургский университет имениФилиппса, Германия). Клеточная линия B. subtilis NA110 была любезно предоставленапроф. М. Салас (Центр молекулярной биологии имени С. Очоа, Автономный УниверситетМадрида, Испания). В работе также использовали коммерчески доступные клеткиB. subtilis MH5636 (Bacillus Genetic Stock Center, США) (табл. III.1).Таблица III.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
