Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 22
Текст из файла (страница 22)
II.30. В обоих случаях максимальная активность РНКП наблюдалась при 37°С, апри 50°С происходила инактивация фермента. При пониженных температурах (4-15°С)наблюдали увеличение интенсивности сигналов, соответствующих 13-звенной пРНК6S-1,тогда как при 25°С эффективность её синтеза резко уменьшалась. Этот фактсвидетельствует о «преждевременной» терминации транскрипции из-за более стабильногокомплексообразования коротких пРНК6S-1 с 6S-1 РНК и потере сродства таких комплексовк РНКП при пониженной температуре. При 3742°С, наоборот, увеличивался выход 15- и16-звенных транскриптов, синтезирующихся на матрице 6S-1 РНК (рис. II.30А).
В случае6S-2 РНК не удалось четко проследить аналогичную тенденцию, хотя при температуре4-15°Сотносительноеколичествосинтезирующихся12-15-звенныхпРНК6S-2посравнению с транскриптами другой длины было больше чем при более высокихтемпературах. Возможно, в условиях холодового шока 15- и 16-звенные пРНК6S-2медленнее диссоциируют из комплекса с 6S-2 РНК и могут выполнять свою функцию,вызывая высвобождение РНКП из её комплекса с 6S-2 РНК. Кроме того, в таких условияхможет изменяться и конформация самой 6S-2 РНК в комплексе с пРНК6S-2.Рис.
II.30. Зависимость длины преобладающих пРНК, синтезирующихся на матрице6S-1 РНК (А) и 6S-2 РНК (Б) от температуры. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S РНК; 100 нг/мклгепарина; 200 мкМ 4×NTP, 0,5мкКи [α-32P]UTP (в случае 6S-1 РНК) или [α-32P]АTP (в случае6S-2 РНК). (А) Дорожка 1 – реакционная семсь в отсутствие 6S РНК (отрицательный контроль).Дорожки 2 и 10 – маркеры длины РНК (М-14 и М-13), 5'-[32P]-меченные олигорибонуклеотидыp146S-1 и р136S-1. Дорожки 3-9 – синтез пРНК6S-1 при температуре 4, 11, 15, 25, 37, 42 и 50°С,соответственно.
(Б) Дорожка 1 и 9 – маркеры длины РНК (М-15 и М-12), 5'-[32P]-меченныеолигорибонуклеотиды p156S-2 и р126S-2. Дорожка 10 – реакционная смесь в отсутствие 6S РНК(отрицательный контроль). Дорожки 2-8 – транскрипция пРНК6S-2 при температуре 4, 11, 15, 25,37, 42 и 50°С, соответственно. Радиоавтографы 25%-ных ПААГ после электрофореза вденатурирующих условиях (7 М мочевина).103Таким образом, в ходе изучения особенностей взаимодействия РНКП с 6S-1 и6S-2 РНК B. subtilis удалось установить факт синтеза пРНК на обеих 6S РНК и определитьнуклеотидные последовательности пРНК6S-1 и пРНК6S-2.
Была продемонстрированаспособность синтезированных пРНК образовывать дуплексы с соответствующей 6S РНК иприводить к высвобождению РНКП из её комплекса с 6S РНК. В ходе исследования былообнаруженоважноеотличиевфункционировании6S-1и6S-2РНК.Длинапреобладающих при транскрипции in vitro пРНК6S-2 (13-16 н.о.) является недостаточнойдля эффективного комплексообразования с 6S-2 РНК, а синтез более протяженныхпродуктов транскрипции, формирующих прочный дуплекс с 6S-2 РНК, незначителен и, повсей видимости, требует особых условий. Показано, что одним из таких условий можетявляться высокая концентрация ATP, стимулирующая синтез пРНК6S-2 длиной 17-18 и 2326 н.о.II.6.
Исследование роли 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis in vivoНа сегодняшний день существует мало данных о физиологической роли6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis in vivo. В работе [52] было показано, что делеция гена bsrA,кодирующего 6S-1 РНК, незначительно замедляет рост клеток в экспоненциальной фазероста. Позднее, было продемонстрировано, что этот эффект обусловлен присутствием6S-2 РНК (bsrB) в отсутствие 6S-1 РНК и максимально проявляется при выходе клеток изстационарной фазы [64] (глава «Обзор литературы», раздел I.2.3.2). Однако никакихдоказательств токсичности 6S-2 РНК для клетки в отсутствие 6S-1 РНК на сегодняшнийдень нет. Поскольку удаление 6S-1 и/или 6S-2 РНК оказывает лишь незначительноевлияние на фенотип клеток B.
subtilis, неизвестно, в каких масштабах при этом изменяетсяэкспрессия клеточных белков. Напомним, что эффект ингибирования транскрипции вприсутствии 6S-1 и 6S-2 РНК экспериментально был установлен только в нашей работе (вусловиях in vitro). Поэтому актуальной задачей является изучение влияния делеций геновbsrA и bsrB на состав клеточных белков методом сравнительного протеомного анализа.Для его проведения необходимо было сконструировать клеточные линии B.
subtilis,нокаутные по генам bsrA и/или bsrB, а также проверить их жизнеспособность. Косвеннымдоказательством функционирования 6S РНК in vivo также является синтез пРНК, однакодетекция таких коротких РНК из-за их малой длины и быстрой деградации в клетках, какправило, затруднена. Поэтому в наших исследованиях использовалась оптимизированнаяметодика блот-гибридизации в варианте Нозерн [145] с применением комплементарных кРНК-мишени зондов смешанной природы олигодезоксирибонуклотидов с включениямиостатков ковалентно замкнутых нуклеозидов (см.
раздел II.5).104II.6.1. Характеристика клеточных линий B. subtilis, используемых длявыяснения роли 6S-1 и 6S-2 РНК in vivoВлабораториипроф.Р.Хартманна(Институтфармацевтическойхимии,Марбургский Университет имени Филиппа, г. Марбург, Германия) на основе штаммаB. subtilis PY79 были получены клеточные линии с делециями генов bsrA и/или brsB(табл. III.1, глава «Экспериментальная часть»).
Из клеток с двойным нокаутом ( brsAB)также были получены штаммы с измененной локализацией генов bsrA или brsB:brsAB+A и brsA+B. Инсерции соответствующих фрагментов ДНК проводили в локусamyE, кодирующий α-амилазу и не являющийся необходимым для жизнедеятельностиB. subtilis. Таким образом, штаммы brsAB+A и brsA+B содержали «комплемент» генаbsrA или brsB. Штамм B. subtilis PY79 является прототрофным производным23 штаммаB. subtilis 168 и в последнее время широко применяется в различных масштабныхгенетических исследованиях в системе B. subtilis [152]. Мы проверили экспрессию (или еёотсутствие) 6S-1 и/или 6S-2 РНК в полученных мутантных штаммах (рис. II.31). Для этогоиспользовали метод блот-гибридизации общей РНК, выделенной из стационарной (для6S-1 РНК) и экспоненциальной (для 6S-2 РНК) фаз клеточного роста с комплементарнымиРНК-зондами,содержащимиостаткиDIG-меченногоуридина(см.главу«Экспериментальная часть»).Рис.
II.31. Сравнительный анализ экспрессии 6S-1 и 6S-2 РНК в различных клеточныхлиниях B. subtilis: PY79(WT) – дикий тип B. subtilis штамма PY79; ΔbsrA и ΔbsrB – B. subtilis PY79с делециями генов brsA или bsrB, соответственно; ΔbsrAB – B. subtilis PY79 с двойной делециейгенов brsA и bsrB; ΔbsrAB+A и ΔbsrAB+B – B. subtilis PY79 с «комплементом» генов brsA или bsrB,соответственно.
Нозерн-блоттинг общей РНК (3 мкг), выделенной из клеток в экспоненциальной(для 6S-2 РНК, A600 ~ 1 ОЕ) или стационарной (для 6S-1 РНК, A600 ~ 4 ОЕ) фазах роста. 6S РНК –контроли, 6S-1 или 6S-2 РНК (2 нг), соответственно.Делеция генов bsrA и/или brsB исключает синтез 6S-1 и/или 6S-2 РНК в клеткахbrsA, brsB и brsAB, а добавление «комплемента» того или другого гена (brsAB+A и23Штамм B. subtilis PY79 впервые был получен в работе [153] путем удаления ауксотрофных маркеровштамма B. subtilis CU1769 (metB5, glnAl00) в процессе двукратной трансдукции фагом PBS1 из лизатовB. subtilis 168. Родительским штаммом CU1769 является B. subtilis W168 – производное B.
subtilis 168,полученное в результате трансформации клеток штамма 168 геномной ДНК прототрофного штаммаB. subtilis W23 (подробнее см. [152]).105brsA+B) является эффективным и приводит даже к некоторому повышению уровняэкспрессии 6S РНК по сравнению с клетками дикого типа (рис. II.31).Проведенные манипуляции с геномом B. subtilis практически не влияли нажизнеспособность и скорость роста клеток (рис. II.32). Различия значений оптическойплотности клеточных культур после 24 ч выращивания являются сравнимыми в пределахпогрешностей измерения, и только клетки с двойным нокаутом генов bsrA и brsBзамедляют скорость роста на стадии перехода из экспоненциальной в стационарную фазу.Незначительное снижение максимальной наблюдаемой оптической плотностизамечено для клеток ΔbsrB по сравнению с клетками дикого типа, однако такой эффект необнаружен для клеточной линии ΔbsrAB+А с «комплементом» гена brsA, и, вероятно, несвязан с отсутствием 6S-2 РНК.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
