Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 17
Текст из файла (страница 17)
II.12. Сравнительный анализ длин продуктов транскрипции in vitro с промоторовгенов rrnO (дорожка 1), rrnB (дорожка 3), veg (дорожка 4), С2φ29 (дорожка 6), cspB (дорожка 7),tuf (дорожка 8), argC (дорожка 9) и appD (дорожка 10). Ф. к.: 200 нМ ДНК, 100 нМ РНКП,200 мкМ каждого из ATP, CTP, GTP, 50 мкМ UTP, 0,5 мкКи [α-32P]UTP. Дорожки 2, 5 – маркердлины РНК (192 н.о., 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК).
Радиоавтографы 5%-ных ПААГ, содержащих 7М мочевину.80Расположение соответствующих радиоактивных зон относительно друг друга имаркера длины РНК (192 н.о.) совпадало с теоретически рассчитанными длинамипродуктов транскрипции. В некоторых случаях также был замечен синтез более длинныхРНК, вероятно, соответствующий неспецифической полноразмерной транскрипции совсего фрагмента ДНК или же обусловленный наличием в последовательностяхдополнительных промоторных элементов, не описанных в литературе. Стоит отметить,что фаговый промотор белка С2 (С2φ29) демонстрировал наибольшую эффективностьтранскрипции, поэтому в последующих экспериментах с участием соответствующегофрагмента ДНК в реакционную смесь добавляли в ~ 10 раз меньше [α-32Р]UTP.На следующем этапе транскрипцию с выбранных промоторов проводили вприсутствии 6S-1 РНК, 6S-2 РНК или РНК РНКазы Р B.
subtilis, как было описано ранеедля промоторов генов rrnB и veg. Для каждого промотора ДНК было проведено не менее 3независимых экспериментов. На основании усреднённых данных для каждого отдельногопромотора были построены диаграммы (рис. II.13). Поскольку эффективность синтезаРНК с промоторов генов rrnO, tuf, argC и appD при пониженной концентрациинуклеозидтрифосфатов (50 мкМ каждого из ATP, CTP, GTP, 12,5 мкМ UTP) былачрезвычайно низка, было решено проводить эксперименты в присутствии 200 мкМкаждого из ATP, CTP, GTP и 50 мкМ UTP.
Как видно из рис. II.13 увеличениеконцентрации каждой из 6S РНК приводит к уменьшению выхода транскрипта в случаевсех выбранных промоторов ДНК. Низкие концентрации РНК РНКазы Р не влияют натранскрипцию1050-кратныхвпределахизбытковпогрешностипоэксперимента,отношениюкРНКПоднакопринаблюдаетсядобавлениизначительноенеспецифическое ингибирование фермента вплоть до 20-50% от исходной активности.В случае промоторов argC и appD не было зафиксировано каких-либо заметныхотличий в ингибировании транскрипции в присутствии 6S-1 и 6S-2 РНК. Эффективностиингибирования промоторов cspB и rrnO в пределах значений погрешностей тоже можносчитать одинаковыми для обеих 6S РНК.
Заметные отличия наблюдались только в случаепромоторов С2φ29 и tuf ингибирующий эффект 6S-2 РНК проявлялся слабее, чем6S-1 РНК. Аналогичная ситуация была зафиксирована в случае промотора rrnB (см.рис. II.10). Для более наглядного представления результатов были построены суммарныеграфикизависимостиотносительныхвыходовтранскриптовскаждогоизрассматриваемых в работе промоторов от концентрации 6S-1 и 6S-2 РНК (рис. II.14).В случае 6S-1 РНК максимальный эффект ингибирования транскрипции проявлялся дляпромоторов генов rrnO и tuf (рис.
II.14А), тогда как степени ингибирования транскрипциис остальных промоторов различались незначительно.81Рис. II.13. Сравнительный анализ ингибирования транскрипции генов посредством 6S-1РНК, 6S-2 РНК и РНК РНКазы Р. Под каждым графиком в качестве примера приведенсоответствующий радиоавтограф 5%-ного ПААГ, содержащего 7 M мочевину. Дорожки 1, 8, 15 –транскрипция в отсутствие нкРНК.
Дорожки 2-6, 9-13, 16-20 – различные концентрации 6S-1 РНК,6S-2 РНК и РНК РНКазы Р, соответственно: 0,1; 0,25; 0,5, 1 и 2 мкМ. Дорожки 7 и 14 – маркердлины РНК (192 н.о., 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК). Профили ингибирования для 6S-1 РНК,6S-2 РНК и РНК РНКазы Р обозначены, соответственно, голубым, фиолетовым и серым цветами.82Рис. II.14. Влияние 6S-1 РНК (А), 6S-2 РНК (Б) на транскрипцию с промоторов модельныхгенов.
Графики зависимость относительного выхода транскрипта (%) от концентрации нкРНК вреакционной смеси.Анализируя результаты транскрипции в присутствии 6S-2 РНК, можно заключить,что эта РНК примерно в одинаковой степени влияет на транскрипцию in vitro пяти израссматриваемыхгеновнезависимоотструктурыихпромоторныхэлементов.Исключением являются только промоторы С2φ29 и rrnB (рис. II.14Б). То естьобнаруженные отличия в ингибировании в присутствии 6S-1 и 6S-2 РНК связаны сповышенной«чувствительностью» промотораtufк6S-1РНК,ипониженной«чувствительностью» rrnB и С2φ29 к 6S-2 РНК.
Сопоставляя полученные результаты снуклеотидными последовательностями промоторных элементов не удалось выявитьникаких закономерностей. По всей видимости, все продемонстированные различия вингибировании транскрипции 6S-1 и 6S-2 РНК зависят от конкретного промотора и,учитывая погрешность эксперимента, не являются значимыми в рамках глобальнойоценкиспособностиобеих6SРНКпрепятствоватьработеРНК-полимеразы.Подтверждением этому может служить различная «чувствительность» транскрипции срассматриваемых промоторов в присутсвии возрастающих количеств РНК РНКазы Р – тоесть даже в случае неспецифического ингибирования.
Известно, что РНКП вопределенных условиях может неспецифически связывать любую ДНК и РНК [44].Обычно данная проблема решается добавлением значительных избытков гепарина –неспецифического конкурента НК-лигандов [32]. В наших экспериментах такжеиспользовался гепарин, однако, при добавлении больших избытков РНК, концентрацияотрицательно заряженных лигандов, видимо, становилась слишком велика, что частичноблокировалоактивностьРНКП.Таким образом,неудалосьвыявитьникакихстатистически значимых отличий в чувствительности проанализированных промоторов кингибированию транскрипции в присутствии 6S-1 и 6S-2 РНК. Тем не менее, впервыебыло продемонстрировано, что обе 6S РНК B.
subtilis могут специфически ингибироватьтранскрипцию генов в системе in vitro.83II.5. Особенности взаимодействия РНКП с 6S-1 и 6S-2 РНК: синтез пРНКВ 2006 г. в научной группе проф. Вассерман [3] было впервые установлено, что6S РНК E. coli может служить матрицей для синтеза РНК-полимеразой короткихтранскриптов длиной от 14 до 24 н.о., названных пРНК (раздел I.2.2.3 в главе «Обзорлитературы»). Позднее две пРНК, комплементарные 6S РНК, длиной 12 и 17 н.о. былиобнаружены в клетках H. pylori [55], а в 2012 г. синтез 32-звенной пРНК былпродемонстрирован для 6S РНК Synechocystis sp. PCC 6803 [59].
Транскрипция РНК наРНК-матрице нехарактерна для ДНК-зависимой РНК-полимеразы и, как следствие,является исключительной особенностью фермента, наблюдаемой в случае 6S РНК.Поэтомуважнойзадачейданногоисследованиябылапроверкавозможноститранскрипции пРНК на матрицах 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis. Для этих целейкомплексообразование каждой из 6S РНК с холоферментом РНКП В.
subtilis проводили вприсутствии четырех нуклеозидтрифосфатов и [α-32P]UTP. Продукты транскрипциианализировали методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях. В присутствии6S-1 РНК наблюдали синтез ряда олигорибонуклеотидов длиной до 14-16 н.о., причем14-звенныевариантыпРНК6S-1транскрибировалисьсмаксимальнойэффективностью (рис. II.15, дорожка 3). В случае 6S-2 РНК также была зафиксированатранскрипция ряда коротких транскриптов длиной от 6 до 16 н.о. и более. Максимальныйвыход транскрипции в этом случае наблюдали для 13-16-звенных продуктов (рис. II.15,дорожка 4).Рис. II.15.
Результаты транскрипцииin vitro на матрице 6S-1 РНК (дорожка 3) и6S-2 РНК (дорожка 4). Ф. к.: 1 мкМ РНКП;1 мкМ 6S РНК; 200 мкМ 4×NTP*, 0,5 мкКи[α-32P]UTP. Дорожки 2 и 5 – маркеры длиныРНК, 5'-[32P]-меченные олигорибонуклеотидыдлиной 13 н.о. и 12 н.о.**, соответственно.Дорожка 1 – реакционная смесь в отсутствие6S РНК(отрицательныйконтроль).Радиоавтограф25%-ногоПААГпослеэлектрофореза в денатурирующих условиях(7 М мочевина).*Для исключения влияния различий вконцентрациях NTP на выход пРНК всеэксперименты вне зависимости от используемого32Р-меченного NTP проводили в присутствииэквимолярных концентраций ATP, CTP, GTP и UTP(если не указано иное).** Продукты транскрипции из-за содержаниятрёх фосфатных групп на 5'-конце РНК,характеризуются меньшей подвижностью в ПААГпо сравнению с синтетическими 5'-[32P]-меченнымиолигорибонуклеотидами той же длины.84Для определения природы стартового нуклеотида в 6S-1 и 6S-2 РНК аналогичныеэксперименты проводили в присутствии [γ-32P]ATP и [γ-32P]GTP19, поскольку толькопервый из встраиваемых РНК-полимеразой нуклеозидтрифосфатов не гидролизуется сотщеплением пирофосфата с 5'-конца.
Было установлено, что синтез пРНК на 6S-1 РНКначинается с остатка G (рис. II.16А, дорожка 4), а синтез пРНК на 6S-2 РНК – с остатка A(рис. II.16Б, дорожка 3).Рис. II.16. Определение нуклеотидных последовательностей пРНК6S-1 и пРНК6S-2 в ходетранскрипции in vitro в присутствии различных [α-32P]- и [γ-32P]-меченных нуклеозидтрифосфатов.(А) Результаты транскрипции in vitro на матрице 6S-1 РНК (1 мкМ).
Дорожка 1 – транскрипция вотсутствие 6S РНК (отрицательный контроль). Дорожки 3 и 11 – маркер длин РНК, смесь5'-[32P]-меченных олигорибонуклеотидов длиной 6, 7 и 8 н.о. Дорожки 2 и 4 – транскрипция вприсутствии [γ-32P]ATP и [γ-32P]GTP, соответственно. Дорожки 5, 6, 7 и 10 – транскрипция вприсутствии [α-32P]GTP, [α-32P]UTP, [α-32P]СTP и [α-32P]АTP, соответственно. Дорожки 8 и 9 –транскрипция в присутствии [α-32P]GTP и [α-32P]UTP, соответственно, при одновременномотсутствии ATP. (Б) Результаты транскрипции in vitro на матрице 6S-2 РНК (1 мкМ). Дорожка 1 –маркер длин РНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
