Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 13
Текст из файла (страница 13)
от основной TSS [121]. В результатепреждевременной терминации транскрипции образуется короткий продукт экспрессииминорного промотора – DHFR нкРНК. Поскольку основная промоторная область генаDHFR содержит протяженные поли(dG)-последовательности, DHFR нкРНК благодарякомплементационнымвзаимодействиямможетобразовыватьпурин-пурин-пиримидиновый триплекс между РНК и ДНК. Такой триплекс находится в H-форме, чтопрепятствует узнаванию промотора и сборке ПИК. Исходя из этого, DHFR нкРНК можноотнести к классу нкРНК, ассоциированных с промотором. Однако помимо этого DHFRнкРНК способна непосредственно взаимодействовать с транскрипционном факторомTFIIB в составе собранного ПИК, что приводит к его диссоциации и, как следствие,ингибированию транскрипции [122].61I.3.3.5. GAS5 РНКЕще одним примером эукариотической нкРНК, регулирующей транскрипцию,является GAS5 (growth arrest-specific 5) РНК, идентифицированная при скринингепотенциальных опухолевых супрессоров в 1988 г.
[123]. В обычных условиях GAS5 РНКбыстро подвергается деградации, однако в условиях сывороточного голодания варестованных (остановленных на определенной стадии роста) клетках, или при обработкеингибиторамитрансляциинаблюдаетсяиндукцияеёэкспрессиииповышениестабильности [124]. Гены gas5 мыши и человека содержат, соответственно, 9 или 10интронов, кодирующих мякРНК, и 12 экзонов, кодирующих GAS5 РНК (рис. I.36А).Рис.
I.36. (А) Структурная организация гена gas5 человека. Экзоны 1-12 отмечены белымиквадратами, интроны U44, U47, U74-U81 – черными квадратами [125]. (Б) Схема ингибированиятранскрипции глюкокорстикоидзависимого гена в присутствии GAS5 РНК [126].После транскрипции РНКП II синтезированная пре-мРНК гена gas5 подвергаетсяальтернативному сплайсингу, что приводит к существованию различных изоформ GAS5РНК [126]. Основными вариантами GAS5 РНК являются так называемые GAS5a (598 н.о.)и GAS5b (630 н.о.) РНК, содержащие экзоны 7а или 7b, соответственно. Однако в клеткебыли найдены и более длинные изоформы GAS5 РНК (~ 1200–1800 н.о.), содержащиеодну или несколько последовательностей, кодирующих мякРНК [125].В нормальных условиях убиквитинилированная и полиаденилированная GAS5 РНКассоциирована с рибосомой в цитоплазме [127].
При аресте клеточного роста GAS5 РНКтранслоцируется в ядро, где взаимодействует с глютикортикоидным рецепторомGR (рис. I.36Б) [125]. GR является транскрипционным фактором и в присутствиекофакторов–глюкокортикоидов–связываетнуклеотидныепоследовательностиGRE (gluticorticoid responsive element) в промоторных областях глюкокортикоидзависимыхгенов (в том числе антиапоптозных), тем самым активируя их транскрипцию.62Вторичная структура функциональной части GAS5 РНК имитирует конформациюпалиндромнойGRE-последовательностиДНКd(5'-AGAACANNNTGTTCT-3'/3'-TCTTGTNNNACAAGA-5', где N=A, T, C, G) и конкурирует с последней за связывание сGR. В результате белок теряет способность взаимодействовать с промоторами иактивировать их транскрипцию (рис.
I.37), что приводит к снижению эффективностиклеточного метаболизма, а также повышает вероятность перехода клеток в апоптоз [128].Можно провести аналогию между механизмами ингибирования GR-рецептора с помощьюGAS5 РНК и РНКП с участием бактериальной 6S РНК, вторичная структура которойнапоминает ДНК-промотор (раздел I.2).Рис. I.37. (А) Предсказанная вторичная структура функциональной области GAS5 РНК (400598 н.о.). GRE-имитирующие Участки GAS5 РНК, имитирующие GRE-последовательности,выделены штриховой линией.
Н.о. G540 и С554 отмечены черными квадратами. Комплементарныепары нуклеотидов отмечены синим и красным цветами, неканонические пары нуклеотидов U•G –зеленым цветом. (Б) Трехмерная модель ДНК-связывающего домена GR, взаимодействующего сGRE ДНК (слева) и GRE-имитирующим участком GAS5 РНК (справа). Нуклеозиды,контактирующие с K442 и R447 ДНК-связывающего домена GR, выделены красным [125].В ходе делеционного анализа GAS5 РНК был выявлен конкретный участок молекулы(400-598 н.о.), ответственный за связывание с рецептором GR и ингибирование егоактивности [125]. Данная область закодирована в 12-ом экзоне гена gas5 и встречается во63всех найденных изоформах GAS5 РНК.
Как видно из рис. I.37А, шпилька 5 содержитдвухцепочечный фрагмент, кодирующий последовательности GRE-1 (539-544 н.о.) иGRE-2 (553-559 н.о.), которые имитируют участок узнавания GR в ДНК. Два н.о. – G540 иС554 (рис. I.37А) – консервативны среди консенсусных GRE-последовательностейчеловека и взаимодействуют, соответственно, с K442 и R447 а.о. ДНК-связывающегодомена белка GR. Замена каждого из этих а.о. (или обоих) на остаток Ala приводят ксущественной (или почти полной) потере сродства белка GR к GAS5 РНК.
На основаниипредполагаемой вторичной структуры шпильки 6 в GAS5 РНК и кристаллическойструктуры ДНК-связывающего домена фактора GR была построена трехмерная модель ихкомплекса (рис. I.37Б). В комплексе белка GR с GRE ДНК а.о. K442 и R447 направлены вбольшую бороздку ДНК и взаимодействуют с нуклеозидами G7 и G4, расположенными впротивоположных цепях ДНК и разделенными расстоянием в половину витка двойнойспирали. Два н.о.
G540 и С554 в GAS5 РНК также разделены половиной витка спирали иориентированы в пространстве аналогично нуклеозидам GRE в ДНК. Нуклеотидныезамены в данной области GAS5 РНК, нарушающие GRE-имитирующий двухцепочечныйучасток, а также замена С554U при сохранении стабильности двойной спирали,приводили к потере способности GAS5 РНК ингибировать GR-зависимую транскрипциюс MMTV (mouse mammary tumor virus) промотора in vivo [125].GAS5 РНК нестабильна в раковых клетках и подвергается деградации с помощьюмеханизма, распознающего«бессмысленные» последовательности мРНК- NMD(nonsense-mediated RNA decay) [124].
Таким способом раковые клетки повышают своюжизнеспособность в условиях нехватки питательных веществ [127]. Помимо своейосновной функции GAS5 РНК способна подавлять экспрессию многих других стероидзависимых рецепторов. Это позволяет провести аналогию между GAS5 РНК и SRA РНК и,возможно, свидетельствует о схожести механизмов регуляции транскрипции с помощьюэтих нкРНК [125].Таким образом, огромное количество идентифицированных на сегодняшний деньнкРНК вовлечено в различные процессы регуляции транскрипции, как на уровнеконкретных генов, так и на более глобальном уровне. Многообразие этих нкРНК имеханизмов их действия, несомненно, указывает на их чрезвычайную важность дляжизнедеятельности клетки и её адаптации в стрессовых условиях.
Сходные черты,наблюдаемые в случае бактериальных и эукариотических нкРНК, позволяют выявитьобщие закономерности и направления эволюции. В связи с этим изучение 6S РНК изразличных бактерий представляет собой перспективную задачу для исследования.64ГЛАВА IIМАЛЫЕ НЕКОДИРУЮЩИЕ 6S-1 И 6S-2 РНК ИЗ BACILLUS SUBTILIS:СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ И ФУНКЦИЙ(Обсуждение результатов)Как было описано в разделе I.2, малые некодирующие 6S РНК играют чрезвычайноважную роль в клетках прокариот, взаимодействуя с РНКП и ингибируя транскрипциюмногих генов. Исключительной особенностью грамположительной бактерии В. subtilisявляется наличие двух различных 6S РНК (6S-1 и 6S-2) длиной 190 и 203 н.о.,соответственно, выделенных при иммуносоосаждении с РНКП В. subtilis [52, 53].Отнесение обнаруженных РНК к 6S РНК было сделано в первую очередь на основепредсказания их вторичных структур, как и 6S РНК E. coli представляющих собойнерегулярную двойную спираль с обширным расплетенным участком в центре (см.
разделI.2.3.2., рис. I.18) [44]. Однако никаких экспериментальных доказательств ингибирующейспособности 6S-1 и/или 6S-2 РНК В. subtilis, как в условиях in vitro, так и in vivo, влитературе описано не было. На основании анализа профилей экспрессии обеих 6S РНК вклетке, полученных в работе [4], было высказано предположение, что 6S-1 РНК В. subtilisявляется гомологом 6S РНК E. coli, поскольку её максимальная концентрациянаблюдалась в стационарной фазе роста клеток. Присутствие 6S-2 РНК на протяжениивсейэкспоненциальнойфазыростаклетоксталонеожиданнымоткрытием,подтвержающим отличие её свойств, а возможно и функций, от 6S РНК E. coli.В связи с этим основной целью работы являлся сравнительный анализ свойств 6S-1 и6S-2 РНК В. subtilis для выяснения их возможной роли в ингибировании транскрипциигенов. В первую очередь необходимо было выделить холофермент РНКП В.
subtilis, атакже получить генетические конструкции для Т7-транскрипции 6S-1 и 6S-2 РНКВ. subtilis. Для характеристики способности 6S-1 и 6S-2 РНК ингибировать транскрипциюпланировалось провести комплексообразование этих нкРНК с РНКП и оценить сродствокаждой из 6S РНК к ферменту, а также изучить влияние этих нкРНК на транскрипцию invitro с природных промоторов модельных генов В. subtilis. Как было описано вразделе I.2.2.3, характерной чертой 6S РНК является использование их РНК-полимеразойдля РНК-зависимого синтеза коротких транскриптов – пРНК. В связи с этим необходимобыло проверить, осуществляется ли синтез пРНК на матрицах 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis иоценить эффективность этого процесса.
Для установления функциональной роли 6S-1 и6S-2 РНК in vivo было решено провести сравнительный анализ жизнеспособностиклеточных линий В. subtilis, содержащих делеции генов bsrA и/или bsrB (кодирующих6S-1 и 6S-2 РНК, соответственно), а также сравнить полные протеомы полученных65нокаутных штаммов с клетками дикого типа. Таким образом, комплексный подход кхарактеристике 6S-1 и 6S-2 РНК, включающий в себя in vitro и in vivo анализ их свойств ифункций, позволил бы ответить на вопрос об участии этих нкРНК в регуляциитранскрипции и о возможном отличии механизмов их взаимодействия с РНКП от6S РНК E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
