Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 8
Текст из файла (страница 8)
I.21Б).Рис. I.21. (А) Нуклеотидная последовательность FC РНК. Серым выделенфункциональный участок (FC* РНК). (Б) Кристаллическая структура FC* РНК [67] и схематичноеизображение структурных элементов молекулы (обозначены соотвествующими цветами: 5'«петля» – бордовым, 5'-«стебель» – розовым, 3'-«стебель» – желтым, 3'-«петля» – зеленым).Четыреатома брома изображены красными сферами.Было показано, что FC* РНК ингибирует сборку ПИК РНКП II на промоторе ДНК,однако не связывает молекулы РНКП, вовлеченные в транскрипцию. То есть FC* РНКпрепятствует инициации транскрипции, но не влияет на элонгацию, поскольку неспособна вытеснить ДНК из комплекса с РНКП II.
Выяснение конкретного механизмавзаимодействия FC* РНК с РНКП стало возможным благодаря установлению структурыданного комплекса методом РСА (рис. I.22) [67].38Рис. I.22. Кристаллическая структрура (3,8 Å) полноразмерной 12-тисубъединичнойРНКП II S. сerevisiae в комплексе с FC* РНК (вид сверху) [67].
Домены фермента, расположенныевблизи FC* РНК, отмечены цветами.На основании полученых кристаллографичеких данных был сделан вывод, чтоFC* РНК связывается с РНКП II в её активном центре и взаимодействует с доменами«зажим» (clamp) и «вилка» (fork) фермента, вызывая расширение ДНК-связывающеготуннеля и конформационные изменения в домене «вилка». Основные РНК-белковыеконтакты образуются, главным образом, с 5'-концевой шпилькой FC* РНК, в то время как3'-конец молекулы имитирует промотор ДНК в элонгационном комплексе с РНКП II.Участки связывания этих двух НК-лигандов практически полностью перекрываются(рис.
I.23A). Нуклеотидные замены и удлинение 5'-шпильки лишь незначительно снижаютсродство FC* РНК к РНКП II, и только полное нарушение вторичной структуры FC* РНКделает невозможным взаимодействие этих биомолекул друг с другом.Вопрос, на какой именно стадии сборки ПИК происходит связывание FC* РНКостается открытым, но существует гипотеза, основанная на данных РСА [67]. Инициациятранскрипции на промоторе ДНК начинается с образования так называемого «закрытого»комплекса РНКП, когда один из основных транскрипционных факторов TFIIB образует«мост» между РНКП иДНКнадДНК-связывающимканалом. В результате«расплавления» промотора и образования транскрипционного «пузыря» кодирующая цепьДНКвходитвДНК-связывающийканалРНКПиобразуется«открытый»комплекс (рис.
I.23Б).СопоставлениекристаллическихструктуркомплексовРНКП-FC*РНКиРНКП-TFIIB показало, что FC* РНК не мешает связыванию TFIIB с РНКП, и, как39следствие, не препятствует образованию «закрытого» комплекса. С другой стороны,связывание FC* РНК не позволяет цепи ДНК войти в ДНК-связывающий канал иисключает возможность образования «открытого» комплекса.Рис. I.23. (А) Совмещение кристаллических структур FC* РНК и промотора ДНК вэлонгационном комплексе с РНКП II [68].
(Б) Взаимодействие FC* РНК с РНКП II препятствуетобразованию «открытого» комплекса, и тем самым ингибирует транскрипцию [67].Таким образом, являясь на сегодняшний день единственной регуляторной нкРНК,закристаллизованной в комплексе с РНКП, FC* РНК наглядно демонстрирует вероятныймеханизм ингибирования транскрипции, возможно, присущий также и природным нкРНК,связывающимся с данным ферментом. Основными нкРНК, для которых показановзаимодействие с РНКП II, являются РНК, транскрибируемые с мобильных генетическихэлементов.I.3.2 Регуляторные РНК, кодируемые SINE-элементамиSINE-элементы(shortinterspersedelements)представляютсобойкороткиеповторяющиеся ретротранспозоны длиной от 80 до 400 нуклеотидных пар (н.п.),расположенные хаотично в геноме высших эукариот. Нуклеотидные последовательностиSINEs, обладающие 65-90%-ным сходством, образуют соответствующие семейства, ачисло гомологичных SINE-элементов может варьироваться в пределах от 10 тысяч домиллиона копий на клетку [69]. Исторически SINE-элементы рассматривали как«генетический мусор», необходимый только для установления филогенетических связеймежду различными организмами и изучения видообразования млекопитающих.
Однакопозднее было обнаружено, что транскрипция SINE-«генов» активируется в клетках в ответна тепловой шок или какие-либо другие стрессовые условия. Кроме того, как оказалось,SINE-элементы обладают разнообразными эволюционно важными биологическимифункциями и вовлечены в процессы регуляции экспрессии генов, локализации мРНК имогут служить мобильными промоторами РНКП II [70].40Наданныймоментизвестно,чтоSINE-последовательностинекодируютсобственные белки и транскрибируются РНКП III благодаря наличию в их 5'-концевойчасти промоторных элементов – так называемых А- и Б-боксов, расположенных нарасстоянии 30-40 н.п.
друг от друга. Таким образом, продукты транскрипции SINEэлементов – SINE РНК – можно рассматривать как нкРНК. Совершенно неожиданнымстало открытие способности SINE РНК связывать РНКП II и тем самым ингибироватьтранскрипцию. Основные результаты в данной области получены для B1 и B2 РНК мышии Alu РНК человека [71].I.3.2.1 Alu РНК человека и B1 РНК мышиСвое название SINE-элемент Alu получил благодаря тому, что содержитповторяющийся палиндромный тетрануклеотид 5'-d(AGCT)-3', являющийся участкомузнавания эндонуклеазы рестрикции из Arthrobacter luteus (R.AluI).
В геноме человекасодержится более миллиона копий Alu-последовательностей, кодирующих Alu РНК, чтосоставляет около 10,6% ядерной ДНК. SINE-последовательности, кодирующие B1 РНК,встречаются существенно реже. Так, в клетках мыши их насчитывается не более550 тысяч[72].ОсновнымсходствомAluиB1 РНКявляетсяихвторичнаяструктура (рис. I.24).Рис.
I.24. Схематичное изображение вторичных структур B1 РНК мыши (140 н.о.) иAlu РНК человека (281 н.о.). Фрагмент Alu РНК длиной 146 н.о., известный как «правая рука»,обозначен как Alu-RA [73].Полноразмерная Alu РНК длиной около 280 н.о.
представляет собой тандемныйповтор двух B1-подобных элементов, соединенных 20-звенным А-богатым линкером.В клетках человека присутствует также и вторая форма Alu РНК – короткий продуктпроцессинга полноразмерной Alu РНК, локализованный в цитоплазме – scAlu (shortcytoplasmatic Alu) длиной 118 н.о., представляющий собой полный аналог B1 РНКмыши [74].НеобычноестроениеAlu РНКпослужилопричинойназванияеё41структурированных частей соответственно «левой» (идентичной scAlu РНК) и «правойрукой» (Alu-RA (right arm), 135-280 н.о.
Alu РНК) [73]. Как Alu, так и B1 РНК способнысвязывать РНКП II с высокой эффективностью (Kd ~ 3 нМ), причем Alu РНК образует двакомплекса, обладающих различной электрофоретической подвижностью в геле внеденатурирующих условиях. Тогда как связывание B1 РНК, scAlu РНК, или мутантнойAlu-RA приводит к образованию только одного комплекса с РНКП II. Последующиеисследования подтвердили, что каждая из «рук» Alu РНК может связывать одну молекулуРНКП со сравнимыми значениями Kd (~ 3 нМ) образующихся комплексов. Однако толькополноразмерная Alu РНК и её мутантная форма, представляющая собой фрагмент Alu-RA,способны ингибировать транскрипцию in vitro [73].
Таким образом, Alu РНК содержит двапространственно разделенных РНКП-связывающих домена, но лишь один из них отвечаетза репрессию транскрипции. Данный факт согласуется с тем, что, несмотря на высокоесродство B1 РНК мыши к РНКП II в экспериментах in vitro, не было зафиксированоингибирования транскрипции [75, 76]. В то же время химерная РНК, состоящая из B1 РНКи Alu-RA демонстрирует способность подавлять активность РНКП II, сравнимую свлиянием полноразмерной Alu РНК [73].Изучение свойств различных делеционных мутантных форм Alu РНК (рис. I.25)выявило два конкретных участка РНК, необходимых для репрессии транскрипции.В первую очередь таким участком является центральная наименее структурированнаяобласть «правой руки» Alu РНК (участок L, рис. I.25), содержащая три последовательных«петли», соединенных короткими динуклеотидными «мостиками». Наименее ожидаемымрезультатом оказалась необходимость наличия А-линкера для проявления способностиAlu РНК ингибировать действие РНКП II.
Тем не менее, только двойная мутация –одновременное удаление участка L и уменьшение длины А-линкера в два раза (удаление10 н.о. в центре) приводило к полному исчезновению регуляторной функцииполноразмерной Alu РНК.Таким образом, можно однозначно утверждать, что Alu РНК помимо двухРНКП-связывающих доменов, расположенных в «левой» и «правой руке», имеет дваразличных ингибирующих домена, ответственных за функцию Alu РНК как репрессоратранскрипции.
Оба этих домена расположены в «правой руке» молекулы. B1 РНК иscAlu РНК,неспособныеингибироватьтранскрипцию,имеюттолькоРНКП-связывающий домен. Тем не менее, низкие значения констант диссоциациикомплексов данных РНК с РНКП II предполагают их участие в блокировании фермента.Каким же образом в таком случае происходит транскрипция? Как оказалось, за«освобождение» РНКП II от ассоциированных с ней нкРНК отвечает фактор42транскрипции TFIIF, связывание которого с ПИК приводит к диссоциации B1 РНК иscAlu РНК из комплекса с PНКП II, в то время как функционально активная Alu РНК, атакже B2 РНК (см.
раздел I.3.2.2) остаются связанными с РНКП II [77].Рис. I.25. Способность делеционных мутантов Alu (А) и Alu-RA РНК (Б) ингибироватьтранскрипцию РНКП II in vitro [73].Поскольку в условиях in vivo TFIIF обычно ассоциирован с РНКП II еще до сборкиПИК на промоторе ДНК, вероятно, «бесполезное» связывание нкРНК, не регулирующихтранскрипционную активность РНКП, просто не происходит. Тем не менее, точныймеханизм действия TFIIF неизвестен. Связывание этого транскрипционного фактора скомплексом нкРНК:РНКП исключает его прямую конкуренцию с ДНК/РНК-лигандами.
Вто же время непосредственных контактов между самим TFIIF и B1 или scAlu РНК такжене было обнаружено, по крайней мере, в условиях in vitro [77]. Наиболее приемлемойгипотезой в данном случае является ослабление РНК-белковых контактов в результатеконформационных изменений в самой РНКП, вызываемых присоединением TFIIF.43I.3.2.2 В2 РНК мышиВ2 РНК мыши – это малая ядерная РНК длиной 178 н.о., которая отвечает зарегуляцию транскрипции, осуществляемой РНКП II. Экспрессия В2 РНК в клеткахгрызунов, как правило, является ответом на различные стрессовые ситуации, в первуюочередь на тепловой шок [78].
Также было продемонстрировано, что B2 РНКаккумулируется в клетках в ответ на УФ-облучение, обработку антибиотикомциклогексимидом или заражение вирусной инфекцией. Кроме того повышение уровняB2 РНК зафиксировано в эмбриональных и раковых клетках [79].Было показано, что В2 РНК выделяется вместе с РНКП II при иммуносоосажденииядерных экстрактов клеток, подвергнутых тепловому шоку [75] и способна ингибироватьтранскрипцию in vitro [76]. Эти и другие факты позволяют утверждать, что В2 РНКявляетсяэукариотическиманалогомбактериальной6S РНК,регулирующейтранскрипцию за счет непосредственного связывания с РНКП (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
