Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Припереходе в стационарную фазу (20 и 24 ч) наблюдается появление 147-звенного продуктагидролиза 6S-1 РНК [57].Удаление гена ssrS, кодирующего 6S-1 РНК, приводит к изменению экспрессииоколо 135 генов, кодирующих совершенно различные белки. Экспрессия лишь 8 белковвозрастала в отсутствие 6S-1 РНК. Четыре из них участвуют в метаболизме аминокислот(рис. I.16А). Для большинства генов наблюдалось ингибирование транскрипции, то есть внормальных условиях 6S-1 РНК осуществляет прямое или косвенное стимулирование ихэкспрессии.
Среди выявленных белков можно выделить две большие группы,ответственные за транспорт и метаболизм аминокислот. Также можно отметить белки,участвующиевпроцессахДНК (рис. I.16Б).Интересно,стрессовойадаптации,что6S-1 РНКнокаутрепликацииприводиткирепарациисущественномууменьшению деления L. pneumophila в зараженных клетках человека и амебыAcanthamoeba castellanii, однако не влияет на рост L. pneumophila в питательныхсредах [57].32Рис. I.16. Анализ генов, экспрессия которых подавляется (А) или активируется (Б) в клеткахL.
pneumophila посредством 6S-1 РНК [57]. Гены классифицированы на основании известных илипредполагаемых функций кодируемых ими белков.* Белки секреционной системы типа IV Icm/dot (intracellular multiplication/defective in organelle),формирующие Legionella-содержащую вакуоль (LCV, Legionella containing vacuole) в клетке-хозяине.Таким образом, в отличие от 6S РНК E.
coli, являющейся глобальным ингибиторомтранскрипции σ70-зависимых промоторов в стационарной фазе, 6S-1 РНК L. pneumophila,наоборот, активирует экпрессию огромного количества генов. Соответственно, нельзяоднозначно утверждать, что взаимодействие 6S-1 РНК L. pneumophila с РНКП приводит кблокированию активности последней. Кроме того, на сегодняшний момент неясно, можетли полноразмерный вариант 6S-1 РНК эффективно связывать РНКП или это являетсяпрерогативой зрелой 6S-1 РНК длиной 147 н.о.ВклеткахL.pneumophilaбылатакжеобнаруженавторая6S РНК,экспрессирующаяся в десятки раз эффективнее, чем 6S-1 РНК [58]. В случаеинфицирования L.
pneumophila клеток Acanthamoeba castellanii уровень экспрессии6S-2 РНК также был на порядок выше, чем 6S-1 РНК. Интересно, что 6S-2 РНКтранскрибируется в двух вариантах с каждой из цепей гена с образованием продуктовдлиной 175 (+) и 150 н.о. (-), соответственно. Транскрипция «антисмысловой» 6S-2 РНКменее эффективна, однако уровень её экспрессии меняется в зависимости от фазы роста иинфицирования клетки-хозяина, что вероятно указывают на возможную функциональнуюрольданноготранскрипта.Принимаявовниманиепалиндромнуючастичносамокомплементарную организацию любой 6S РНК, можно предположить, что и данныйтранскрипт имеет стабильную вторичную структуру и может связывать РНКП. Тем неменее, на сегодняшний день не существует данных о возможных функциях и свойствахкак «смысловой», так и «антисмысловой» 6S-2 РНК.I.2.3.2 Две 6S РНК Bacillus subtilisВ 2002 г.
в двух независимых работах [52, 53] были опубликованы данные поидентификации в B. subtilis двух различных нкРНК, соответственно названных поаналогии с геном ssrS в E. coli – bsrA (6S-1) и bsrB (6S-2) (рис. I.17).33Рис. I.17. Схемы расположения генов bsrA (A) и bsrB (В) B. subtilis и нуклеотидныепоследовательности их промоторных элементов.
Промоторные элементы -35 и -10 и стартовыеточки транскрипции (отмечены стрелками) подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Индексd (дезокси) при написании последовательностей ДНК опущен.6S-1 РНК существует в клетке в виде зрелой формы длиной 190 н.о. и её прекурсорадлиной 201 н.о. Нуклеазы, осуществляющие гидролиз пре-6S-1 РНК с 5'-конца поканеизвестны. 6S-2 РНК длиной 203 н.о. транскрибируется без последующего процессинга.Обе нкРНК также выделяются при иммуносоосаждении с холоферментом σA-РНКПB.
subtilis (σA является гомологом σ70 E. coli) [44]. Предсказание вторичных структур обеих6S РНК (подтверждённое экспериментами по пробингу для 6S-1 РНК [4]) позволилоутверждать,что6S-1и6S-2 РНКимеютхарактерную6S-подобнуюформу,представляющую собой протяженную шпильку с обширным расплетенным участком вцентре (рис. I.18А).Синтез зрелой 6S-1 РНК и её предшественника возрастает с ростом клеточнойкультуры и достигает максимума в ранней стационарной фазе (рис. I.18Б). Пре-6S-1 РНКпрактически отсутсвует в лаг- и ранней экспоненциальной фазах, а затем ихколичественное соотношение со зрелой 6S-1 РНК выравнивается.
Транскрипция 6S-2 РНКнаблюдается главным образом в ранней или промежуточной экспоненциальной фазахроста клеток (рис. I.18В) в зависимости от условий проведения эксперимента [53; 4].В стационарной фазе 6S-2 РНК практически отсутствует в клетке, что совершенно несогласуется с существующей на данный момент моделью функционирования 6S РНК.Нокаут гена bsrB не приводил к существенным изменениям при культивации клеток, втом числе в условиях спорообразования, повышенных температур (45°С) или высокойконцентрации соли (10% (m/V) NaCl) [53].34Рис. I.18. Предсказанная вторичная структура зрелой 6S-1 РНК (190 н.о.) и 6S-2 РНК(203 н.о.) B. subtilis [44] (А) и профили экпрессии 6S-1 РНК (Б) и 6S-2 РНК (В) B.
subtilis,полученные при обсчете интенсивностей радиоактивных зон при Нозерн-блот-гибридизации с32Р-меченными ДНК-зондами к 6S-1, 6S-2 или 5S РНК [4]. Для нормирования использоваласьинтенсивность 5S РНК в точке, соотвествующей 3 ч культивирования клеток.В работе [64] было проведено сравнение различных мутантых клеточных линийB. subtilis 168, содержащих как одиночные делеции генов bsrA (нокаут bsrA) или bsrB(нокаут bsrB), так и делецию обоих генов (двойной нокаут bsrAB). Отсутствие6S-1 или/и 6S-2 РНК не приводили к каким-либо заметным изменениям в фенотипемутантных клеточных линий при стандартном культивированиии клеток.
Единственноеотличие было обнаружено при наблюдении за ростом клеток после выхода изстационарной фазы после разбавления клеточной культуры свежей питательной средой(1:500 (V/V)). Клетки, лишенные 6S-1 РНК, задерживались в лаг-фазе на 1-2 ч посравнению с другими клеточными линиями, хотя в начале экпоненциальной фазы даннаяклеточная культура росла с той же скоростью и достигала тех же значений оптическойплотности, что и другие линии (рис. I.19А) [64].
Такой эффект не наблюдался в случаедвойного нокаута, исходя из чего авторами был сделан вывод, что именно 6S-2 РНК вотсутствие 6S-1 РНК ответственна за «опоздание» клеточного роста.На основе клеток с одиночнымнокаутом bsrA и двойным нокаутом bsrAB былиполучены линии, несущие плазмиду, в которой были закодированы, соотвественно,природные гены bsrA и bsrB (bsrA+A и bsrA+B,bsrAB+A и bsrAB+B) или гены,содержащие мутации 6S-1 и 6S-2 РНК (bsrA+Am и bsrA+BmbsrAB+Am и35bsrAB+Bm). Внесенные мутации полностью исключали образование центрального«пузыря» во вторичных структурах обеих 6S РНК и приводили к потере ими способностисвязывать РНКП.Рис. I.19.
Кривые роста различных клеточных линий B. subtilis после разбавления12-часовой клеточной культуры свежей культуральной средой. (A) Сравнение кривых ростаклеток дикого типа и нокаутных по генам bsrA или/и bsrB (Б) Сравнение комплементныхклеточных линий, полученных на основе нокаута bsrA.
(В) Сравнение комплементных клеточныхлиний, полученных на основе нокаута bsrAB [64].Как видно из рис. I.19Б, комплемент гена 6S-1 РНК полностью восстанавливаетфенотип клеток bsrA, тогда как другие комплементные клеточные линии по-прежнемузадерживаются в лаг-фазе. С другой стороны, только комплемент гена 6S-2 РНК приводитк запаздыванию роста клеток bsrAB (рис. I.19В).
Эти исследования указывают наопределенную роль 6S-2 РНК в клетке и её непосредственную связь с 6S-1 РНК,поскольку наблюдаемые эффекты обнаружены только в тех клетках, в которых природная6S-2 РНК оставалась единственной функционирующей 6S РНК. Стоит отметить, чтонефункциональный аналог 6S-2 РНК не вызывает таких изменений фенотипа клеток(bsrA+Bm и bsrAB+Bm). Тем не менее, причины задержки клеток в лаг-фазе,обусловленные наличием 6S-2 РНК на фоне отсутствия 6S-1 РНК неясны.Таким образом, конкретные функции каждой из 6S РНК в L. pneumophila и B.
subtilisна данный момент неизвестны. Свойства этих 6S РНК и их участие в процессах регуляциитранскрипции в случае обеих бактерий, очевидно, существенно отличаются отобщепринятой модели для 6S РНК E. coli. Дальнейшие исследования структуры ифункций 6S РНК из различных организмов позволят глубже понять истинные механизмыдействия данных нкРНК и, возможно, выявить общие аспекты их функционирования вклетках.36I.3. Некодирующие РНК, регулирующие активность РНКП IIв клетках эукариотРНК-полимераза II (РНКП II) – основной фермент, отвечающий за транскрипцию вэукариотических клетках.
Для образования преинициаторного комплекса РНКП (ПИК) напромоторе ДНК требуется наличие ряда основных факторов транскрипции GTF (generaltranscription factors), в первую очередь TBP (TFIID), TFIIB и TFIIF, а также TFIIA, TFIIH иTFIIE. Кроме того, существует огромное количество белков, активирующих илиподавляющих активность РНКП, связываясь с собранным ПИК или препятствуя егоправильному образованию. Однако аналогичные функции могут выполнять и малыенекодирующие РНК, осуществляющие контроль над активностью ко-регуляторовтранскрипцииилиженепосредственноРНКП,например,путемимитациифункциональных элементов промотора ДНК [65]. Наиболее известными нкРНК,регулирующимитранскрипциювэукариотахзасчетвзаимодействиястранскрипционными факторами, являются SRA РНК, 7SK и TAR РНК, U1 мяРНК,GAS5 РНК, DHFR РНК, а B1 и B2 РНК мыши и Alu РНК человека способны связыватьсянепосредственно с РНКП (рис.
I.20).Рис. I.20. Схема основных типов взаимодействий известных на данный момент нкРНК,модулирующих активность РНКП II и/или взаимодействующих с факторами инициациитранскрипции (TF) или другими белками-активаторами РНКП II (Act). Зелеными стрелкамиобозначен активирующий эффект нкРНК, красными - ингибирующий эффект [2].В качестве распространенной модели исследования РНК-связывающей активностиРНКП используется FC РНК, представляющая собой синтетический аптамер.I.3.1 FC РНК – аптамер, связывающий РНКП IIВысокоспецифичное связывание РНК-аптамеров с молекулами-мишенями широкоиспользуется в научных исследованиях, в том числе и для установления конкретныхмеханизмов различных молекулярных процессов, происходящих в клетке.
Одним из такихаптамеров является FC РНК, специфически взаимодействующая с РНКП II Saccharomycescerevisiae и ингибирующая её активность [2].37FC РНК представляет собой 80-звенный олигорибонуклеотид (рис. I.21А),сконструированный в 1997 г. в научной группе проф. Сонтнэка [66]. Как было показанопозднее в экспериментах по футпринтингу, функциональной частью FC РНК является 33звенная область (FC* РНК), которая так же эффективно связывает РНКП II, как иполноразмерная РНК (Kd равны 33 и 20 нМ для FC* РНК и FC РНК, соответственно) [67],и имеет характерную вторичную структуру в виде «вилки» из двух элементов «стебельпетля». Концевые 5'- и 3'-«стебли» содержат 4 и 6 спаренных нуклеотидов,соответственно, и образуют дуплекс, имеющий А-подобную форму. Модель FC* РНКбылаподтвержденакристаллографическиманализомсиспользованиеммодифицированного олигорибонуклеотида, содержащего 5-бромуридин в положениях 12,17, 27, 28 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
