Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 2
Текст из файла (страница 2)
subtilis является важным продуцентом протеаз, амилаз,аминокислот и некоторых полисахаридов, которые необходимы в народном хозяйстве.Некоторые штаммы B. subtilis также используются в качестве пробиотиков дляприготовления лекарственных препаратов [6].Целью данной работы являлось сравнение свойств и функций малых некодирующих6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis.В ходе работы необходимо было решить следующие задачи: исследовать способность 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis ингибироватьтранскрипцию in vitro, сравнить сродство 6S-1 и 6S-2 РНК к РНКП B.
subtilis, установить возможность синтеза РНК-полимеразой коротких транскриптов(пРНК) на матрице 6S-1 и 6S-2 РНК, изучить влияние 6S-1 и/или 6S-2 РНК на экспрессию белков B. subtilis in vivo.В результате проведенных исследований нами впервые продемонстрировано, что6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis способны ингибировать транскрипцию генов, взаимодействуя сРНКП, а также могут служить матрицами для синтеза пРНК.
Показано, что экспрессиямногих белков регулируется с помощью 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis, что свидетельствует оважной роли обеих 6S РНК для жизнедеятельности клетки.Работа содержит обзор литературы, в котором рассматриваются примеры регуляциитранскрипции с помощью некодирующих РНК (нкРНК) как в бактериях, так и вэукариотических клетках. Основное внимание уделено малым нкРНК, непосредственновзаимодействующим с РНК-полимеразой.7ГЛАВА I.МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ПОСРЕДСТВОМНЕКОДИРУЮЩИХ РНК В ПРОКАРИОТАХ И ЭУКАРИОТАХ(Обзор литературы)I.1.
Природа и разнообразие некодирующих РНКНасегодняшнийденьнаоснованииданныхтранскриптомногоанализаэукариотических геномов можно с уверенностью утверждать, что лишь 1-2% РНК вклетке кодирует белки, в то время как подавляющее большинство транскриптов являетсянекодирующими РНК. «Репертуар» генов, кодирующих белки, по всей видимости,оставался относительно статичным в ходе эволюции, в то время как число некодирующихпоследовательностей заметно возрастало при переходе к более сложным организмам.Данное наблюдение подтверждается большим количеством исследований, выявляющихвсе новые и новые биологические функции нкРНК.
Поскольку уровень экспрессиибольшинства нкРНК достаточно низок по сравнению с мРНК, предполагается, что онивыполняют, главным образом, регуляторные функции. Действительно, к настоящемумоменту известно много фактов функционирования нкРНК в процессе развития клетки,при ответе на различные стрессы или изменения условий окружающей среды [7].С функцияминкРНКсвязанобольшоеколичествочасторазнонаправленныхмолекулярных механизмов, таких как активация транскрипции генов и подавление ихэкспрессии,импринтингидеметилированиеДНК,интерференцияРНКиремоделирование хроматина.
Кроме того, изменение уровня экспрессии тех или иныхнкРНК отмечены при разных типах рака и неврологических заболеваниях. Таким образом,наличие неоспоримых свидетельств участия нкРНК во многих клеточных процессахпозволяет сделать вывод об их исключительно важном значении для клетки [8].Существует несколько различных классификаций нкРНК. В зависимости от длинывсе нкРНК могут быть разделены на три класса: (1) микроРНК и малые интерферирующиеРНК (миРНК) длиной ~ 18-25 нуклеотидных остатков (н.о.), (2) малые нкРНК ~ 20300 н.о., являющиеся, как правило, регуляторами транскрипции и трансляции и (3)длинные некодирующие РНК (lncRNA) >200-10000 н.о., роль которых в клеткемногообразна.
Функционально все нкРНК могут быть условно классифицированы наструктурные и регуляторные. Постоянно экспрессирующимися структурными нкРНКявляются в первую очередь рибосомные (рРНК), транспортные (тРНК), малые ядерные(мяРНК) и малые ядрышковые РНК (мякРНК). К основным регуляторным нкРНК могутбыть отнесены микроРНК, миРНК, длинные некодирующие РНК, а также РНК,8взаимодействующие c piwi-белками1 [7]. Недавно были также описаны два новых классанкРНК: РНК, ассоциированные с промотором, и энхансерные РНК [9, 10].Также можно отдельно выделить целый ряд регуляторных нкРНК, контролирующихтранскрипцию в клетках эукариот.
К ним относят прежде всего 7SK мяРНК и TAR РНК,регулирующие активность фактора элонгации P-TEFb; U1 мяРНК, стимулирующуютранскрипцию посредством связывания с инициаторным фактором TFIIF; SRA РНК,активирующую стероидные рецепторы и др. Данные нкРНК вовлечены в сложныемногостадийные механизмы регуляции и взаимодействуют, как правило, с целымкаскадом белков, оказывая, главным образом, косвенное воздействие на процесстранскрипции [2]. Тем не менее, существуют нкРНК, напрямую взаимодействующие сРНКП II – это B1 и B2 РНК мыши и Alu РНК человека.Однако регуляция посредством нкРНК не является отличительной особенностьюэукариот.
Последние исследования позволили идентифицировать огромное количествомалых нкРНК, выполняющих разные функции, в клетках E. coli и других бактериях.На данный момент известно более 140 бактериальных нкРНК, в том числе около 80 из нихобнаружены в E. coli [11].НкРНК помогают бактерии приспосабливаться к изменениям окружающей средыпутем воздействия на инициацию транскрипции, пост-транскрипционную регуляцию,инициацию трансляции, модификацию мембран и на множество других процессов.Многие нкРНК являются крайне необходимыми регуляторными элементами приклеточном ответе на стресс, заражении бактериофагами [12, 13]. БольшинствопрокариотическихрегуляторныхнкРНКвыполняетсвоифункциизасчеткомплементационных взаимодействий с мРНК-«мишенями», и, как следствие, изменяетстабильность и/или влияет на трансляцию последних. Действуя пост-транскрипционно,такие нкРНК являются основными участниками отдельной стадии регуляции экспрессиигенов, полностью независящей от процессов, происходящих при транскрипции мРНК [14].Например, OxyS РНК транскрибируется в клетке в ответ на окислительный стресс и,взаимодействуя с участком связывания рибосомы мРНК некоторых генов, блокирует ихтрансляцию.
Одной из мишенейOxySРНК является генrpoS, кодирующийσS-субъединицу РНКП. Интересно, что его трансляцию могут, наоборот, активироватьдругие малые нкРНК – RprA и DsrA РНК, экпрессирующиеся в условиях осмотическогошока и при пониженных температурах, соответственно. Эти нкРНК взаимодействуют с5'-областью мРНК гена rpoS и расплетают шпилечную структуру, препятствующую1Piwi-белки (от англ.
«P-element induced wimpy testis») – класс регуляторных белков, экспрессирующихсяисключительно в зародышевых клетках млекопитающих и вовлеченных в процессы дифференциациистволовых клеток, сперматогенез и в «молчание» транскрипции генов ретротранспозонов.9посадке рибосомы [15]. Недавно было показано, что группа РНК-регуляторов, известнаякак CRISPR РНК (сlustered regularly interspaced short palindromic repeats), образует базовуюадаптивную иммунную систему бактериальных клеток, формирующуюся при попадании вклеткуплазмидыиприинфицированииеёфагами.CRISPRРНКявляютсяпрокариотическим аналогом миРНК, и благодаря комплементационным взаимодействиямсвязывают фаговые ДНК и РНК, вызывая их последующую деградацию [16]. Похожуюфункцию выполняет RyhB РНК, которая связывается с различными мРНК, что приводит ких последующему ферментативному гидролизу [15]. Чрезвычайно важной для клеткиявляется и rnp РНК – каталитическая субъединица фермента РНКазы Р, осуществляющейпроцессинг пре-тРНК.
Наконец, некоторые нкРНК непосредственно связываются срегуляторными белкам и модулируют их активность. В настоящее время известнонесколькотакихнкРНК:CsrB/CsrC,RsmX/RsmY/RsmZ,Rsdи6S РНК[12].Предполагается, что принцип их действия основан на сходстве их вторичных структур сдругими нуклеиновыми кислотами, являющимися мишенями для связывания белков.Так, например, CsrB (~ 350 н.о.) и CsrC (~ 220 н.о.) РНК вместе с белком CsrAобразуют так называемую регуляторную систему CsrABC (carbon storage regulator),встречающуюся в клетках E. coli и других бактерий.
CsrABC отвечает в первую очередь заподдержание баланса между процессами синтеза гликогена из сахаров и егоиспользования в процессе гликолиза, а также за образование внеклеточных компонентовдвижения [17]. Белок CsrA в свободной форме ингибирует трансляцию другого белка –GlgC, участвующего в синтезе гликогена. Связываясь в виде димера с нетранслируемойобластью мРНК гена glgC вблизи последовательности Шайна-Дальгарно, CsrAпрепятствует посадке рибосомы и вызывает быструю деградацию glgC-транскриптов.
В тоже время взаимодействие белка CsrA с мРНК гена flhDC повышает стабильностьпоследней, и, как следствие, активирует синтез в клетке флагеллина – основногокомпонента бактериальных жгутиков. CsrB и CsrC РНК состоят, соотвественно, из 18 и 9шпилек, петли которых содержат участок узнавания белка CsrA – последовательность5'-GGA-3'. Как следствие, CsrC и CsrB РНК могут связывать до 9-18 молекул белка CsrA ине позволяют ему образовать комплексы с мРНК.Аналогом регуляторной системы CsrABC в клетках Pseudomonas fluorescens иLegionella pneumophila является система RsmXYZ-RsmA.
RsmY и RsmZ РНК длиной,соотвественно, ~ 120 н.о. и ~ 130 н.о. представляют собой гомологи CsrB РНК E. coli ивзаимодействуют in vitro с белком CsrA E. coli с достаточно высокой эффективностью, таккак тоже содержат в петлях шпилечных структур мотивы 5'-GGA-3' (рис. I.1). Единичныенокауты генов rsmY и rsmZ практически не влияют на изменение вирулентности10L. pneumophila. Однако двойной нокаут генов приводит к значительному снижениюэффективности деления L.
pneumophila в клетках моноцитарно-макрофагального рядачеловека и в амебе Acanthamoeba castellanii, а также к блокированию перехода клеток изстадии репликации в стадию трансмиссии [18]. Суперэкспрессия RsmY и RsmZ РНКприводила к активации синтеза гликогена и формированию биопленки, аналогичнопроцессам в клетках E. coli. Некоторые виды бактерий рода Pseudomonas также содержатдополнительную гомологичную RsmX РНК длиной ~ 115 н.о.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
