Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 10
Текст из файла (страница 10)
В работе [76] было продемонстрировано, что B1 и B2 РНК имеютсравнимую степень сродства к ферменту. Позднее было установлено, что обе РНКконкурируют друг с другом за связывание с активным центром РНКП II и вытесняют другдруга из комплекса с белком [77]. Возникает закономерный вопрос – способна ли B1 РНКпрепятствовать функционированию B2 РНК? В экспериментах in vitro было показано, чтоB2 может ингибировать транскрипцию даже в том случае, когда ПИК предварительносвязан с B1 РНК [77]. Проводя аналогии между B1 РНК и scAlu РНК (раздел I.3.2.1),можно предположить, что данные нкРНК могут быть вовлечены в механизмы «снятия»эффекта ингибирования при определенных условиях путем замены активных ингибиторовB2 и Alu РНК на их нефункциональные аналоги.Удивительно, что помимо непосредственного блокирования РНКП II, В2 РНКтакжеучаствуетвдополнительныхпроцессах,контролирующихпротеканиетранскрипции [82].
Так, например, В2 РНК в комплексе с РНКП II специфическиингибирует фосфорилирование остатков серина Ser2 и Ser5 в большой субъединицеРНКП II (Rpb1), осуществляемое фактором транскрипции TFIIH, проявляющим киназнуюи хеликазную активности. Данные остатки серина входят в состав гептапептидныхповторов YSPTSPS, встречающихся с частотой около 26 раз в С-концевом домене (CTD)48Rpb1, и узнаются после фосфорилирования различными белками, выполняющимико-транскрипционный процессинг мРНК или модифицирование гистонов. Процессфосфорилирования напрямую связан с активностью РНКП II: CTD Rpb1 в инициаторномкомплексе с РНКП не фосфорилирован, в то время как его гиперфосфорилированиенаблюдается при элонгации транскрипции.
Замена как Ser2, так и Ser5 на Ala или Glu вкаждом гептапептидном повторе приводит к гибели дрожжевых клеток [83].Поскольку в обычных условиях Ser2 фосфорилируется после Ser5, достаточнобыло изучить наличие или отсутствие в составе Rpb1 фосфорилированной формы (Ser-P)только Ser5. С помощью метода иммуноферментного анализа в варианте Вестерн сиспользованием различных антител было показано, что содержание Ser5-P в Rpb1 всоставе ПИК на актиновых промоторах резко сокращается в условиях теплового шока,несмотря на присутствие в ПИК активного TFIIH.
С учетом того, что уровень TFIIH вклетках после теплового шока практически не уменьшается, полагают, что ингибируетсясама киназная активность TFIIH. Тем не менее, это происходит только в том случае, когдаполимераза, связанная с В2 РНК, находится на промоторе ДНК и только тогда, когдаВ2 РНК добавлена в реакцию перед образованием «закрытого» комплекса.
ДеградацияВ2 РНК с помощью РНКаз приводит к восстановлению фосфорилирирующей активностиTFIIH. Исходя из этих фактов можно сделать вывод, что сам фактор TFIIH не являетсямишенью для связывания В2 РНК, и репрессия его активности является результатомвзаимодействия В2 РНК непосредственно с РНКП II.Еще одной неожиданной особенностью В2 РНК явилась её способность ксобственной элонгации в комплексе с РКНП II [84]. Несмотря на то, что большинствоРНК-полимераз являются ДНК-зависимыми (за исключением РНКП ретровирусов), влитературе описан ряд случаев синтеза РНК на РНК-матрице. Например, как былорассмотрено в разделе I.2, бактериальная РНКП синтезирует короткие транскриптыдлиной до 30 н.о., комплементарные 6S РНК [3].
Дрожжевая РНКП II способнаспецифическиудлинятьсвободные 3'-концы РНКв РНК-дуплексах, используякомплементарную цепь в качестве матрицы [68]. Кроме того, данный механизмиспользуется вирусом гепатита а также вироидами растений, в геноме которых незакодирована РНК-зависимая РНК-полимераза, однако их РНК реплицируется в клеткаххозяев [85].В работе [84] был проведен ряд экспериментов, в которых ПИК РНКП II,связанный с 5'-[32Р]-меченной B2 РНК, обрабатывали клеточными экстрактами вприсутствиисмесинуклеозидтрифосфатов.Этовызывалозаметноеуменьшениеинтенсивности наблюдаемого комплекса РНКП II с B2 РНК, причем отсутствие в49реакционной смеси любого из нуклеозидтрифосфатов не приводило к диссоциации B2РНК.
Отсутствие клеточного экстракта также не влияло на степень комплексообразованияB2 РНК с РНКП II. Это свидетельствует о том, что процесс диссоциации B2 РНК изкомплекса с ферментом связан с транскрипционной активностью РНКП, котораявозможна только в присутствии одного или нескольких факторов, содержащихся вклеточных экстрактах. Полное «выключение» транскрибирующей активности РНКП IIпри обработке клеток мыши α-аманитином7, приводило к возрастанию концентрациисвободной B2 РНК. При аналогичной обработке клеток актиномицином-D8, который«выключает» только ДНК-зависимый синтез РНК, обнаружили увеличение длины однойчасти молекул B2 РНК и ее последующую деградацию, другая же часть молекул B2 РНКоставалась связанной с РНКП и не подвергалась элонгации. В работе [84] также былаустановленаточнаяпоследовательностьсинтезируемогоРНКПIIdenovoдополнительного фрагмента B2 РНК.
Как оказалось, этот участок длиной 18 н.о.,самокомплементарен 3'-концу молекулы В2 РНК (рис. I.29), и, по всей видимости,образует с В2 РНК протяженную стабильную шпильку, несомненно влияющую наконформацию B2 РНК и её взаимодействие с РНКП II.Рис. I.29. Фрагмент B2 РНК (143-178 н.о.). Участок длиной 18 н.о. (выделен рамкой),синтезирующийся de novo при связывании В2 РНК с ПИК, полностью комплементарен участкуB2 РНК (145-162 н.о.) [84].На основе проведенных экспериментов был сделан вывод, что процесс удлиненияB2 РНК в комплексе с РНКП II действительно приводит к его дестабилизации, и является,какминимум,однимизпутей,позволяющих«снять» эффектингибированиятранскрипции.
Точный механизм данного процесса, а также конкретный фактор илифакторы, инициирующие элонгацию B2 РНК, пока неизвестны. Однако на основе данныхкомпьютерного моделирования можно предположить, что удлинение цепи B2 РНК, как илюбой другой РНК, находящейся в активном центре полимеразы, приводит к частичномуоткрытию домена «зажим» РНКП и, как следствие, ослаблению связывания лиганда вкомплексе с ферментом (рис. I.30).7α-Аманитин – циклический октапептид; токсин, выделяемый из грибов рода Amanita, чрезвычайносильный ингибитор транскрипции специфичный к РНКП II.8Актиномицин-D – токсичный антибиотик пептидной природы, синтезируемый бактерией Streptomycesparvallum, специфически ингибирует процесс транскрипции РНК в эукариотах.50Рис. I.30.
Удлинение B2 РНК в активном центре РНКП II, приводящее к стерическимпрепятствиям, дестабилизирующим комплекс B2 РНК – РНКП II.Аналогичный процесс наблюдается и в случае бактериальной РНКП [3] (разделI.2). Таким образом, обнаруженные механизмы регуляции транскрипции посредствомРНК могут свидетельствовать в пользу одной из современных гипотез, согласно которойРНК-полимеразы эволюционно произошли от древних РНК-репликаз [68].I.3.3. Некоторые некодирующие РНК, регулирующие транскрипцию привзаимодействии с транскрипционными факторамиI.3.3.1. 7SK и TAR РНКВпервые малая ядерная 7SK РНК длиной 330-332 н.о. была обнаружена в1976 г.
[86]. Спустя 25 лет было установлено, что она является ключевым компонентом7SK малого ядерного рибонуклеопротеида (7SK мяРНП), который в свою очередьвзаимодействует с мультибелковым фактором элонгации транскрипции P-TEFb (positivetranscription elongation factor b) и ингибирует его активность [87, 88]. P-TEFb человекасостоит из циклин-зависимой киназы 9 (CDK9) и циклина Т1 (СусТ1) или одной из двухальтернативных форм циклина Т2 (CycT2a или CycT2b). Данный фактор требуется дляперехода РНКП II, «приостановленной» на промоторе (так называемые паузытранскрипции) в стадию активной элонгации (рис.
I.31).Как упоминалось выше (раздел I.3.2.2), активность РНКП II напрямую связана сфосфорилированием остатков серина Ser2 и Ser5 в гептапептидных повторах YSPTSPSC-концевом домене (CTD) большой субъединицы РНКП II – Rpb1. В составе ПИК CTDRpb1 немодифицирован.
Его частичное фосфорилирование (в первую очередь Ser5)осуществляет фактор транскрипции TFIIH. В результате РНКП II покидает промотор иначинает транскрипцию. После синтеза короткой цепи мРНК наступает паузатранскрипции. РНКП II останавливается на небольшом расстоянии от инициаторногонуклеотида, и с ней связываются отрицательные элонгационные факторы NELF (negative51elongation factor) и DSIF (5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducingfactor). Эта пауза необходима для привлечения белков, осуществляющих 5'-кэпированиерастущейцепимРНК.Дляпродолжениятранскрипциинеобходимогиперфосфорилирование CTD Rpb1 по остаткам Ser2, которое и обеспечивает P-TEFb.Однако наиболее важной функцией P-TEFb является модификация NELF и DSIF.Фосфорилирование DSIF превращает его в положительный элонгационный фактор, афосфорилированная форма NELF диссоциирует из транскрипционного комплекса,позволяя РНКП II вести эффективную элонгацию и синтезировать полноразмерныемРНК [89].Рис.
I.31. Схема основных стадий транскрипции, осуществляемой РНКП II [89].Привлечение P-TEFb осуществляется благодаря различным ДНК-связывающимфакторам, в том числе белку Brd4 (bromodomain-containing protein 4) (рис. I.31) [90].В отсутствие P-TEFb РНКП II способна синтезировать только короткие 5'-концевыепоследовательности пре-мРНК [91]. Таким образом, P-TEFb необходим для синтезабольшинства клеточных мРНК, и его ингибирование посредством взаимодействия с 7SKмяРНК является важным регуляторным механизмом экспрессии генов в клетках эукариот.Нуклеотидная последовательность 7SK мяРНК консервативна среди геномовпозвоночных. Так, например, последовательности 7SK мяРНК мыши и человекаидентичны на 98% [92].
Хотя в геноме человека закодированы сотни псевдогенов7SK мяРНК, транскрипция данной РНК осуществляется РНКП III только с единственного«истинного» гена, расположенного в шестой хромосоме. Как правило, в клеткесодержится в среднем 200000 копий 7SK мяРНК [93].52Как и все РНК, синтезированные с помощью РНКП III, 3'-конец 7SK мяРНКчеловека длиной 332 н.о. содержит U-богатую последовательность 5'-UCUUUU-3',которая связывается с белком La (lupus9 antigen), защищающим растущую цепь РНК отдеградации и способствующим формированию правильной вторичной структуры [94].В процессе посттранскрипционноой модификации нуклеазы отщепляют от 7SK РНК3'-концевые 1-3 н.о., а затем происходит аденилирование, приводящее к существованию вклеткетрехразличныхвариантовмяРНК,7SKсодержащихна3'-концепоследовательности 5'-UCUA-3', 5'-UCUUA-3' или 5'-UCUUUA-3', соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
