Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Как правило, в ходе транскрипции in vitro наблюдали синтез целого рядапРНК различной длины от 2 до 18-24 н.о. с существенным преобладанием более длинныхпродуктов (рис. I.8Б).Аналогичный процесс наблюдается и при абортивной транскрипции с промотораДНК, когда РНКП, практически не изменяя своего положения относительно стартовойточки транскрипции, синтезирует короткие РНК-«затравки» длиной, как правило, не более15 н.о. [46].
Однако, в отличие от обычных абортивных РНК, быстро диссоциирующих изкомплекса РНКП с промотором, пРНК остаются связанными с 6S РНК за счеткомплементационныхвзаимодействийдетектируемыйпроведенииприиобразуютэкспериментовгибридныйметодомкомплекс,легкогель-электрофорезавнеденатурирующих условиях (рис. I.8Г). Такой комплекс является достаточно стабильными характеризуется меньшей подвижностью в геле, чем свободная 6S РНК.
Помимо этого,образование гибрида 6S РНК:пРНК приводит к его диссоциации из комплекса с РНКП.Добавлениерифампицина(антибиотика,блокирующегоактивныйцентрРНКП)предотвращает синтез пРНК, и, как следствие, образование гибридных комплексов [3; 33].Удаление центральнойобласти6S РНК также исключаетвозможностьсинтезапРНК (рис. I.8Б, В).Изучение механизма синтеза пРНК E.
coli и его влияния на дестабилизациюкомплекса 6S РНК с РНКП проведено в работе [43]. Было высказано предположение, чтосинтез пРНК вызывает конформационные изменения 6S РНК. По-видимому, образованиедуплекса между пРНК и комплементарным участком в 6S РНК нарушает вторичнуюструктуру последней, что приводит к коллапсу центрального петли, образованиюнеструктурированных участков и, как следствие, диссоциации 6S РНК из комплекса сферментом.
Было показано, что предварительно сформированный 6S РНК:пРНК гибридне способен связывать РНКП. Результаты химического и ферментативного пробинга invitro комплекса 6S РНК:пРНК в сравнении со свободной 6S РНК позволили предсказатьвозможное изменение её конформации (рис. I.9). Образование дуплекса между пРНК и24-44 н.о. 6S РНК приводит к разрушению двухцепочечной области, фланкирующейцентральную петлю со стороны 5'-конца свободной 6S РНК. Также велика вероятностьобразования короткой шпильки в районе 53-66 н.о. молекулы. Однако наиболеехарактернымизменениемявляется«замена»короткойшпилечнойструктуры,расположенной напротив центральной петли с «3'-стороны» 6S РНК, на стабильнуюудлиненную шпильку в районе 132 – 152 н.о.: протяженная шпилечная структураобразуется непосредственно между консервативными элементами CRIII и CRIV, ивероятно имеет важное значение для функции 6S РНК (рис.
I.9).23Рис. I.9. Вторичная структура комплекса 6S РНК E. coli с комплементарной пРНК длиной20 н.о. (выделена красным) [43]. Серым шрифтом выделен участок 6S РНК в «свободной»конформации до синтеза пРНК. Консервативные элементы 6S РНК CRI-CRIV выделены синимшрифтом. Пунктирной линией отмечен участок 6S РНК, ставший доступным для гидролизаРНКазой V1, сплошной линией – участки самопроизвольного гидролиза при выдерживании 42 чпри температуре 23°С в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 8,5) и 20 мМ MgCl2 («in-line»probing). Стрелками отмечены остатки G, межнуклеотидная связь после которых гидролизоваласьв присутствии РНКазы Т1.
Черной точкой отмечен остаток G, гидролиз межнуклеотидной связипосле которого уменьшался при образовании комплекса с пРНК.Также в работе [43] было проведено изучение конформационных изменений в 6SРНК E. coli при синтезе пРНК в условиях in vivo. В клеточную культуру добавлялидиметилсульфат (ДМС), метилирующий неспаренные остатки аденина и цитозина.Модифицированные н.о. 6S РНК затем идентифицировали с помощью обратнойтранскрипции (метод «удлинения праймера»). Для детекции изменений во вторичнойструктуре 6S РНК использовали клетки, находящиеся в стационарной фазе роста (когдасинтез пРНК минимален) и клеточную культуру после разбавления свежей культуральнойсредой (когда синтез пРНК максимален).
Было продемонстрировано, что эффективностьмодификации in vivo н.о. A137-A142, С148-G151 в 6S РНК во втором случае существенноснижалась, что свидетельствует об образованииудлиненной шпильки за счетдополнительных комплементарных пар между участками CRIII и CRIV (рис. I.9).
По всейвидимости, существует определенное равновесие между двумя конформациями 6S РНК более «расплетенной» с длинной центральной шпилькой и более компактной с короткойшпилькой напротив центральной петли. Синтез пРНК необратимо смещает равновесие всторону первой конформации, и тем самым вызывает диссоциацию РНКП из её комплексас 6S РНК.В группе проф.
Вагнера [47] была предпринята попытка выявить н.о. 6S РНК,сближенные с активным центром РНКП. Напомним, что ранее в работе [45] былиустановлены а.о. в σ70 (рис. I.7), при замене которых на Ala степень связывания 6S РНК с24холоферментом σ70-РНКП изменялась. Для картирования РНК-белковых контактов вработе [47] был применен новый подход с использованием химической нуклеазыFeBABE4. Для этого был получен ряд мутантных форм σ70-субъединицы РНКП,содержащихединственныйостатокCysвразличныхпозициях(рис.I.10А),предположительно вовлеченных в узнавание промотора. Сульфгидрильная группа остаткаCys реагировала с бромацетамидобензильной функциональной группой в FeBABE собразованием конъюгата σ70-FeBABE.
После реконструкции холофермента РНКП,содержащего FeBABE, проводили комплексообразование с 6S РНК. При добавлении вреакционную смесь аскорбата натрия и пероксида водорода происходил гидролизмежнуклеотидной связи в 6S РНК, сближенной с той или иной мутантной формойσ70-FeBABE-РНКП (рис.
I.10Б, 10В).Рис. I.10. (A) Схема расположения подвергнутых заменам а.о. в σ70-субъединице РНКП.(Б) Вторичная структура и (B) трехмерная модель 6S РНК E. coli, соответственно [47]. Цветомвыделены н.о., сближенные с а.о. мутантных форм σ70: с K376C – зеленые, R422C – желтые,K496C – синие, S517C–красные, D581C–фиолетовые.* GC-богатый дискриминатор – последовательность в ДНК, важная для узнавания промотора вусловиях аминокислотного голодания.4(S)-1-(р-бромацетамидобензил)этилендиаминтетраацетат железа (III).25Было установлено, что 4.2 район σ70, узнающий -35 промоторный элемент в ДНК,взаимодействует с двумя участками во внутренней шпильке 6S РНК (77-78 н.о.
и 101103 н.о.). Домены 3.1, 2.1 и 2.3 σ70, вовлеченные в связывание и «расплавление» участкаДНК между -35 и -10 промоторными элементами, находятся вблизи основания «стебля»внутренней шпильки – нерегулярного двухцепочечного участка, фланкирующегоцентральную петлю с 3'-конца молекулы. U44 вместе с тремя другими н.о. центральнойпетли (А45, А50, U51) образует контакты с 3.2 районом σ70-субъединицы, расположеннымвблизи активного центра РНКП, что согласуется с его функцией в качестве стартовогонуклеотида при синтезе пРНК.
Таким образом, во взаимодействии с σ 70-субъединицейпринимает участие только «половина» молекулы 6S РНК (42-143 н.о.). 3'-/5'-Концевойдвухцепочечный участок 6S РНК может выполнять структурную функцию, а такжевзаимодействовать с β/β'-субъединицами РНКП.Наосновеполученныхрезультатовипредсказаниятретичнойструктурыдвухцепочечных сегментов 6S РНК с помощью программы 3dRNA была создана модельтрёхмерной структуры полноразмерной 6S РНК (рис. I.10В) [47]. Методом молекулярногодокинга проведено наложение полученной модели на кристаллическую структурухолофермента σ70-РНКП E. coli (PDB-код: 4IGC, рис.
I.11). Для правильногопозиционирования 6S РНК использовали трехмерную модель σ70-РНКП E. coli вкомплексе с CAP5-зависимым промотором ДНК (PDB-код: 3IYD) [48]. Как видно изрис. I.11А, 3D-модель 6S РНК идеально вписывается в кристаллическую структурухолофенмента σ70-РНКП. Все участки 6S РНК, для которых было продемонстировановзаимодействие с теми или иными доменами σ70, находятся в непосредственной близостиот подвергнутых заменам а.о. Центральная петля 6S РНК (42-58 н.о.) повторяетгеометрию транскрипционного «пузыря» в ДНК-промоторе (от -11 до +5 н.о.относительно положения TSS), а участок 6S РНК 59-93 н.о.
имитирует промоторнуюобласть ДНК от -12 до -42 н.о. относительно TSS. Два участка гидролиза 6S РНК приобразовании комплекса с РНКП-FeBABE-S517C – U44/A45 и A50/A51 – расположенынепосредственно в активном центре фермента с двух сторон от Ser517. Короткая шпилька133-143 н.о. (рис. I.10Б), существующая в «свободной» конформации 6S РНК (согласновторичной структуре), при связывании с РНКП, по всей видимости, «расплавляется» собразованием неструктурированного участка.
Этот участок 6S РНК на 4 н.о. корочесоотвествующей области в ДНК-промоторе (рис. I.11Б), поэтому изгиб молекулы РНК вданном месте меньше по сравнению с ДНК. Однако ширина НК-связывающего канала в5Сatabolite activator protein – активатор катаболитных оперонов. Гомодимер CAP в комплексе с двумямолекулами циклического AMP связывается с промоторами и активирует транскрипцию.26РНКП является достаточной для размещения 6S РНК в такой конформации.Предполагается, что расплетенный участок РНК в районе 85-88 н.о. и 104-107 н.о.искажает регулярную А-форму двухцепочечной спирали РНК, расширяя большуюбороздку и тем самым делая её более доступной для взаимодействовия с СПС 6-мотивомрайона 4.2 σ70-субъединицы [49].Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
