Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Интересно, что экспрессияRsmX/RsmY/RsmZ РНК активируется специальной двухкомпонентной белковой системойGacA/GacS (LetA/LetS). Белок GacA связывается в промоторной области генов rsmX иrsmZ со специфической палиндромной последовательностью 5'-d(TNAGAAATTTCTNA)3'/ 3'-d(ANTCTTTAAAGANT)-5' (N = A, T, C, G) и стимулирует их транскрипцию.Аналогичные системы были также найдены в клетках Erwinia carotovora, Salmonellatyphimurium и Yersinia pseudotuberculosis [19].Рис. I.1.
Предсказанная вторичная структура RsmX и RsmZ РНК L. pneumophila. Серымикругами выделены консервативные 5'-GGA-3'-мотивы, характерные для РНК, связывающих белокRsmA и его гомологи [18].Еще одной малой нкРНК, связывающейся с белком и регулирующей тем самым егоактивность, является Rcd РНК длиной ~ 70 н.о., которая взаимодействует с триптофаназойTnpA. Точный механизм данного процесса не изучен, однако Rcd РНК повышает сродствобелка к триптофану и стимулирует синтез индола2 в быстро делящихся клетках [20].В отличие от описанных выше нкРНК, осуществляющих регуляцию конкретныхспецифических молекулярных процессов, в клетках прокариот существует еще одна РНК,2В процессе каталитического разложения триптофана образуется пируват-ион, индол и аммиак.11являющаяся глобальным ингибитором транскрипции.
Эта РНК, названная 6S РНК,непосредственно взаимодействует с бактериальной РНКП и блокирует её активный центр,предотвращая узнавание промоторов ДНК [1]. Проводя аналогию с эукариотическиминкРНК, взаимодействующими с РНКП II – можно однозначно говорить о существованииво всех живых системах отдельного механизма РНК-зависимого контроля транскрипции,возможно, имеющего для клетки не меньшее значение, чем регуляция с помощью белков.Таким образом, в настоящем обзоре основное внимание уделяется нкРНК, вовлеченным впроцессы транскрипции в клетках низших и высших организмов и прямо или косвенномодулирующих активность основного транскрипционного фермента – РНКП.I.2. 6S РНК - бактериальная некодирующая РНК, регулирующаятранскрипциюI.2.1. История открытия и первых исследований 6S РНКВпервые 6S РНК была обнаружена в клетках E. coli штамма MRE600 Броунли иСенгером при выделении32Р-меченной 5S РНК для последующего определениянуклеотидной последовательности [21].
Впоследствии оптимизированный для ДНКпротокол стал известен как «секвенирование по Сэнгеру», принесший авторуНобелевскую премию в 1980 г. Таким образом, 6S РНК была одной из самых первыхмолекул РНК, для которых была установлена нуклеотидная последовательность [22]. Темне менее, её функциональная роль в клетке оставалась неизвестной на протяжении более30 лет после открытия.Выделенная из клеток E. coli 6S РНК имела длину 184 н.о. и демонстрировала наудивление высокую устойчивость молекулы к гидролизу.
Предложенная авторамивторичная структура указывала на то, что 6S РНК не является матричной РНК. Тем неменее, 6S РНК присутствовала в больших количествах во всех протестированных линияхE. coli, а также была найдена в родственной E. coli грамотрицательной бактерии Shigelladysenteriae [22]. В ранней логарифмической фазе роста клеток E. coli 6S РНК практическине детектировалась, в то время как в поздней стационарной фазе была зафиксированамаксимальная концентрация 6S РНК в количестве ~ 1000 копий на одну геномнуюДНК [23].Примерно в то же время из клеток HeLa была выделена РНК близкой молекулярноймассы, названная 7S (7SL) РНК [24].
Было установлено, что 7SL РНК является продуктомферментативного гидролиза рибосомной 28S РНК и непосредственно ассоциирована срибосомой в составе рибонуклеопротеинового комплекса SRP, отвечающего за12котрансляционнуютранслокациюбелковчерезмембрануэндоплазматическогоретикулума. Данный комплекс характеризовался коэффециентом седиментации 11S исостоял помимо 7SL РНК из 6 различных полипептидов.
Обнаружение 6S РНК E. coli всоставе аналогичного рибонуклеопротеинового комплекса 11S неизвестного состава, aтакже предсказанное сходство вторичных структур 7SL РНК человека и 6S РНКE. coli [25], позволило предположить общность их функций в качестве РНК-компонентовSRP-комплексов, регулирующих секрецию белков. Однако попытки заменить 7SL РНКчеловека на 6S РНК E. coli при реконструкции комплекса SRP человека не увенчалисьуспехом [26]. В последущих исследованиях была зафиксирована транскрипцияпрекурсора 6S РНК E. coli, содержащего 8 дополнительных н.о.
на 5'-конце молекулы, атакже идентифицирован ген ssrS, кодирующий 6S РНК и представленный в геноме E. coliединственной копией [27]. Это позволило сконструировать мутантные клеточные линииE. сoli. Однако нокаут гена 6S РНК, также как и его суперэкспрессия, абсолютно не влиялна жизнеспособность клеток и секрецию белков по сравнению с клетками дикого типа втемпературном диапазоне 2342°С. Полученные данные наглядно демонстрировалиошибочность существовавшей на тот момент гипотезы о функциональной роли 6S РНК вкачестве компонента SRP-комплекса [28].Немного позднее 6S РНК длиной ~ 180 н.о.
была обнаружена в грамотрицательнойэубактерии Pseudomonas aeruginosa [29]. Как и в случае E. coli, в геноме P. aeruginosaприсутствовалатолькооднакопиягена, кодирующего6SРНК.Определениенуклеотидной последовательности 6S РНК P. aeruginosa позволило рассчитать процентгомологии с 6S РНК E. coli, составивший всего 60%, в то время как гомология 5S РНКмежду соответствующими видами достигала 80%. Тем не менее, обе 6S РНКхарактеризовались приблизительно одинаковым содержанием G/C-пар: 60% и 55% дляE.
coli и P. aeruginosa, соответственно. Несмотря на то, что наиболее протяженныйконсервативный участок в последовательностях этих 6S РНК составлял всего 13 н.о.,авторами были предложены сходные вторичные структуры для обеих 6S РНК (рис. I.2).По мнению проф. Эрдманна и соавт. обе молекулы представляют собой симметричныенерегулярные двухчепочечные РНК с обширным расплетенным участком в центре.Интересным фактом являлась 100% гомология последовательностей длиной 9 н.о.,расположенных в позициях 35-44 и 150-159, соответственно (рис. I.2). Однако на тотмомент, авторами было лишь высказано предположение, что данные участки молекул,образующие соответствующие консервативные элементы вторичной структуры, могутотвечать за узнавание 6S РНК белками.13Рис. I.2. Предполагаемые вторичные структуры 6S РНК E.
coli и 6S РНК P. аeruginosa,предложенные в работе [29]. Гомологичные нуклеотиды отмечены треугольниками, идентичныеучастки молекул выделены рамками. Возможные неканонические комплементационныевзаимодействия отмечены пунктирными линиями.Попытки использовать32P-меченную 6S РНК P. aeruginosa в качестве зонда длягибридизации с геномными ДНК других бактерий (Thermus thermophilus, Bacillus subtilis,Bacillus stearothersouhilus и Halobacterium saris mortui) не увенчались успехом, из чегобыл сделан вывод о низкой степени гомологии 6S РНК среди данных видов.Таким образом, на протяжении 20-ти лет исследований с момента выделения исеквенирования ученым не удалось выявить функциональную роль 6S РНК в клетке.Поскольку манипуляции с геном ssrS не приводили к изменению фенотипа клеток,изучение структуры и свойств 6S РНК было приостановлено влоть до 2000 г.К тому времени в E.
coli помимо рибосомной 5S и тРНК были обнаружены еще9 некодирующих РНК, вовлеченных в различные механизмы регуляции клеточнойжизнедеятельности[30]. Например, оказалось, что выделенная ранее 10S РНК,представляет собой смесь двух различных РНК одинаковой длины: 10Sa и 10Sb РНК (M2и M1 РНК). М2 РНК является транспортно-матричной РНК (тмРНК), участвующей втерминации трансляции, а М1 РНК – рибонуклеиновой составляющей бактериальнойРНКазы Р, ответственной за процессинг тРНК.
РНК OxyS и DsrA вовлечены в процессыстрессового ответа клетки на присутствие перекиси водорода и понижение температуры,соответственно. Суперэкпрессия DicF РНК препятствует нормальному делению клетки.Большое количество нкРНК, взаимодействующих как с белками, так и с другими РНК,было найдено и в клетках эукариот. Такое многообразие функций лишь незначительногоколичества известных на тот момент малых нкРНК вызвало стремительно возрастающийинтерес к данной теме и заставило ученых пересмотреть концепцию, согласно которойосновные роли РНК в клетке отводились мРНК, рРНК и тРНК. Настоящим открытием14стало исследование, опубликованное в журнале Cell группой американских ученых подруководством проф.
Вассарман [1], которые впервые показали, что 6S РНК E. coli можетслужить глобальным ингибитором транскрипции за счет непосредственного связывания сРНК-полимеразой E coli. Данная работа представляла собой полноценное и детальноеисследование, позволившее не только констатировать факт участия 6S РНК в регуляциитранскрипции, но и предположить и частично доказать конкретный механизмфункционирования 6S РНК в клетке, актуальный и к настоящему моменту.I.2.2. 6S РНК Escherichia coliI.2.2.1.
Функция 6S РНКРНКП является одним из важнейших ферментов в клетке, осуществляющим синтезРНК с ДНК-матрицы. Бактериальная РНКП, как правило, состоит из 5 субъединиц: двух α,β, βʹ и ω, образующих так называемый кор-фермент, способный к элонгациитранскрипции. Однако узнавание промоторов и инициация транскрипции возможнытолькохолоферментомРНКП,содержащимвсвоемсоставедополнительнуюсубъединицу σ. В нормальных условиях роста клетки основным фактором транскрипции вE. coli является σ70, тем не менее были обнаружены как минимум 7 дополнительныхвариантов σ-факторов, ответственных за транскрипцию с тех или иных промоторов, в томчисле в стрессовых условиях [31].Правильноефункционированиеклеткиобеспечиваетсясуществованиемразнообразных способов регуляции транскрипции практически на любой из стадий,главным образом при участии активаторов или ингибиторов транскрипции белковойприроды.
Поэтому совершенно неожиданным оказался тот факт, что данную функциюможет выполнять малая некодирующая 6S РНК. Еще в 1978 г. было показано, чтокоэффициент седиментации клеточного экстракта E. coli, содержащего 6S РНК,составляет ~ 11S, в то время скорость осаждения депротеинезированной 6S РНКсоответствует 6S [23].
Таким образом, большая часть 6S РНК в клеточном экстрактенаходится в связанном с другими молекулами виде. Впервые состав фракции11S клеточного экстракта из штамма E. coli К12 удалось охарактеризовать лишьв 2000 г. [1]. Выделенный из данного комплекса белок массой ~ 40 кДа былидентифицирован методом масс-спектрометрического анализа как α-субъединица РНКполимеразы E. coli, а два более тяжелых белка массами ~ 150 кДа представляли собой β- иβʹ-субъединицы. Взаимодействие 6S РНК с РНКП являлось специфичным: присоосаждении РНКП антителами к кор-ферменту 6S РНК являлась единственным лигандомнуклеотидной природы, присутствие которого детектировалось в осажденных фракциях.15Прииспользовании нокаутнойпо генуssrSклеточнойлинии никакихРНК,соосаждающихся с ферментом, зафиксировано не было. Соосаждение 6S РНК с РНКПнаблюдалось только в случае холофермента, содержащего σ70-субъединицу, и необнаруживалось в случае кор-фермента РНКП или холофермента РНКП, содержащегофактор σ32 (активный при стрессовых ответах).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
