Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 6
Текст из файла (страница 6)
I.11. (А) Трехмерная модель 6S РНК E. coli в комплексе с холоферментомσ -РНКП [47]. Подвергнутые замене а.о. σ70-субъединицы выделены цветом: K376C – зеленым,R422C – желтым, K496C – синим, S517C – красным, D581C – фиолетовым. Н.о., образующиеконтакты с той или иной мутантной формой σ70 выделены соответствующим цветом.(Б) Совмещение кристаллической структуры CAP-зависимого ДНК-промотора (голубой) и моделитрехмерной структуры 6S РНК E. coli (зеленая).70В работе [47] был проведен анализ комплексообразования мутантных форм 6S РНК,содержащих нуклеотидные замены и/или делеции в участках С85-G88 или/и G66-С71, схолоферментом σ70-РНКП.
Как оказалось, все варианты 6S РНК в значительной степениили полностью теряли сродство к РНКП. Кроме того, замены н.о. С85-G88 и A1046«Спираль-поворот-спираль», англ. HTH (helix-turn-helix).27С107 (см. рис. I.10Б), не влияющие на вторичную структуру, также вызывали снижениесродства 6S РНК к РНКП, что свидетельствует о чрезвычайной важности данных районовмолекулы.Отметим, что на сегодняшний день не существует кристаллической структуры6S РНК. Единственным успехом в данной области является получение кристалловкороткого двухцепочечного фрагмента 6S РНК из Aquifex aeolicus, который представляетсобой продукт деградации, происходящей непосредственно при кристаллизации [50].Природная 6S РНК A.
aeolicus имеет длину 162 н.о. и её предполагаемая вторичнаяструктура представлена на рис. I.12А. Для кристаллизации использовался укороченныйвариант 6S РНК длиной 132 н.о., содержащий нуклеотидные замены U18G, C19G ирасположенные напротив них G149C и G148C для стабилизации концов молекулы [50].Закристаллизованный фрагмент РНК образует регулярный 12-звенный дуплекс А-формы,содержащий три неканонические пары G•U (рис. I.12Б-Г).Рис. I.12. (А) Предполагаемая вторичная структура 6S РНК A. aeolicus [50]. Подвергнутыезамене н.о. отмечены звездочкой. Закристаллизованный участок выделен красной рамкой.(Б) Схема основных комплементационных взаимодействий в закристаллизованном фрагментеРНК.
(В) Кристаллическая структура РНК-дуплекса с разрешением 2,6 Ǻ (PDB-код: 4JRT).(Г) Контакты между тремя неканоническими н.о. с участием двух молекул воды (изображены ввиде красных сфер).На основании совокупности исследований структуры и свойств 6S РНК E. coli и еёвзаимодействия с РНКП была предложена модель функционирования этой нкРНК вклетке (рис. I.13) [33].28Рис. I.13. Схема функционирования 6S РНК в системе E.
coli [33]. Транскрипция6S РНК-зависимых генов посредством холо-РНКП (экспоненциальная фаза) ингибируетсябольшим количеством 6S РНК в условиях недостатка питательных веществ (стационарная фаза).При возобновлении активного роста РНКП диссоциирует из комплекса с 6S РНК в результатесинтеза пРНК.6S РНК связывается с холоферментом σ70-РНКП за счет структурного сходства сДНК-промотором в «открытом» комплексе в зависимости от фазы роста клетки. В случаедефицита питательных веществ и перехода клетки в стационарную фазу ростаконцентрация 6S РНК возрастает, что приводит к блокированию большей частихолофермента σ70-РНКП.
Тем не менее, комплексы РНКП со специфическими факторамитранскрипции (характерными для тех или иных стрессовых условий) остаются при этомактивными. Когда количество питательных веществ вновь приходит в норму, клеткенеобходимо восстановление нормальной транскрипционной активности. В этих условияхна матрице 6S РНК происходит синтез пРНК, которые образуют стабильный комплекс6S РНК:пРНК.
Вместе с пРНК 6S РНК покидает РНКП и подвергается деградации,позволяя ферменту вновь беспрепятственно вести транскрипцию с промоторов ДНК.Ферменты, участвующие в гидролизе 6S РНК и комплекса 6S РНК:пРНК на сегодняшнийдень не установлены.29I.2.3. Характеристика 6S РНК из различных бактерийВ 2005 г. в результате компьютерного анализа последовательностей нкРНК имоделирования их вторичных структур было предсказано наличие 6S РНК, гомологичных6S РНК E. coli., более чем для 100 различных видов бактерий [4].
Все обнаруженныегомологи 6S РНК имели самокомплементарные участки и с высокой степеньювероятности образовывали двухцепочечную спираль с центральным «пузырем». Такимобразом, согласно проведенному исследованию практически все классы бактерийсодержат как минимум один гомолог 6S РНК, однако, для некоторых бактерийпредсказано наличие двух и более гомологов 6S РНК (табл. 1).Таблица 1. Список бактериальных видов, для которых предполагается наличие несколькихгомологов 6S РНК (левый столбец), и для которых экспрессия 6S РНК подтвержденаэкспериментально (правый столбец).Виды, содержащие несколькогомологов 6S РНК [4]Виды, в которых экспрессия 6S РНК в клеткеподтверждена экспериментальноBacillus subtilis*Bacillus halodransClostridium acetobutilicumLegionella pneumophila*Magnetococcus sp.MC-1Magnetospirillum magnetotacticum sp.
MS-1Oceanobacillus iheyensisThermoanaerobacter tengcongenisAquifex aeolicus [51]Bacillus subtilis* [52, 53]Bradyrhizobium japonicum [54]Escherichia coli [21]Helicobacter pylori [55]Listeria monocytogenes [56]Legionella pneumophila* [57, 58]Nostoc sp. PCC 7120 [59]Prochlorococcus marinus MED4 [60]Pseudomonas aeruginosa [29]Salmonella enterica [61]Shigella dysenteriae [22]Sinorhizobium meliloti [54]Staphylococcus aureus [62]Synechocystis sp. PCC 6803 [59]Synecoccus sp.
PCC7942, PCC6301 [59, 63]* Виды, для которых экспрессия в клетке двух различных 6S РНК подтверждена экспериментальноКсожалению, существуетмалоэкспериментальныхданных, связанныхсфункционированием 6S РНК в данных системах. Тем не менее, эти единичныесвидетельства демонстрируют некоторые очевидные отличия в механизмах действия6S РНК из других клеточных систем по сравнению с 6S РНК E.
coli. Например, показано,что 6S РНК из H. pylori служит матрицей для синтеза двух различных вариантов пРНК,симметричнотранскрибирующихсяспротивоположныхсторонцентрального«пузыря» (рис. I.14А) [55]. Предполагаемая вторичная структура 6S РНК из Synechocystissp. PCC 6803 содержит дополнительную стабильную шпильку вблизи 5'-конца молекулы,которая тем не менее не препятствует специфическому синтезу пРНК длиной до 32 н.о.(рис.
I.14Б).306S РНК океанической цианобактерии Prochlorococcus marinus MED4 можеттранскрибироваться как с собственного промотора, расположенного после гена purK,кодирующего фосфорибозиламиноимидазолкарбоксилазу, так и в составе дицистроннойпре-purK-6S РНК [60]. В первом случае образуется короткий транскрипт (220 н.о.), а вовтором случае после процессинга образуется более длинный вариант 6S РНК (332 н.о.).Интересно, что дополнительный 5'-домен (1-132 н.о.), присутствующий в длинномтранскрипте, может образовывать две различные стабильные конформации, одна изкоторых представляет собой дополнительный 6S-подобный структурный элемент срасплетенной центральной частью. Уровни экпрессии альтернативных вариантов 6S РНКProchlorococcus MED4 зависят от времени суток, и достигают максимума в дневноевремя.
Короткий транскрипт превалирует в клеточных культурах с повышеннойплотностью, а более длинный вариант 6S РНК имееет два пика экпрессии – в конце лагфазы и во время перехода клеток в стационарную фазу роста. Изменение абсолютныхзначений концентраций 6S РНК в обоих случаях не превышало 3-5 раз [60].Рис.
I.14. Преполагаемые вторичные структуры 6S РНК H. pylori (A) и 6S РНКSynechocystis sp. PCC 6803 (Б) на основе данных химического и ферментативногопробинга [55, 59]. Красными стрелками отмечено направление синтеза пРНК, стартовыйнуклеотид отмечен красным кружком.Вклеткахазотфиксирующихα-протеобактерийSinorhizobiummelilotiиBradyrhizobium japonicum, в отличие от E. coli, уровень транскрипции 6S РНК практическине изменяется при переходе из экспоненциальной в стационарную фазу (увеличиваетсямаксимум в 2 раза в S. meliloti) [54]. Экспериментально подтверждено наличие двухразличных 6S РНК (6S-1 и 6S-2) в клетках грамположительной бактерии B.
subtilis [52, 53]и грамотрицательной бактерии L. pneumophila [57, 58], относящихся к классуγ-протеобактерий.31I.2.3.1. Две 6S РНК Legionella pneumophila6S-1 РНК из L. pneumophila проявляет все типичные черты 6S РНК: имеетконсервативную вторичную структуру, аккумулируется главным образом в стационарнойфазе роста клетки (рис.
I.15) и выделяется при иммуносоосаждении вместе с РНКП [57].Полноразмерная 6S-1 РНК имеет длину 182 н.о. Однако последние 35 н.о. с 3'-концамолекулы представляют собой последовательность, идентичную Rho-независимомутерминатору транскрипции, и не влияют на функции 6S РНК. Действительно, встационарной фазе роста клеток наблюдается появление 147-звенного продукта3'-процессинга 6S-1 РНК, лишенного данной области (рис. I.15В).Рис. I.15. (A) Предсказанная вторичная структура 6S-1 РНК L. pneumophila (147 н.о.).(Б) Кривая клеточного роста L. pneumophila и (В) результаты блот-гибридизации общей РНК,выделенной из клеток в разные промежутки времени, с зондами к 6S-1 РНК и 5S РНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
