Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. ЛомоносоваХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиБУРЕНИНА ОЛЬГА ЮРЬЕВНАМАЛЫЕ НЕКОДИРУЮЩИЕ 6S-1 И 6S-2 РНК ИЗ BACILLUS SUBTILIS:СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ И ФУНКЦИЙДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наук02.00.10 – биоорганическая химияНаучный руководитель:доктор химических наук,профессор Кубарева Е.А.МОСКВА – 2014СОДЕРЖАНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................
4ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................... 6ГЛАВА I.Механизмы регуляции транскрипции посредством некодирующих РНКв прокариотах и эукариотах (Обзор литературы) .......................................................... 8I.1. Природа и разнообразие некодирующих РНК ................................................................8I.2. 6S РНК - бактериальная некодирующая РНК, регулирующая транскрипцию ..........12I.2.1. История открытия и первых исследований 6S РНК ...........................................12I.2.2.
6S РНК Escherichia coli ..........................................................................................15I.2.2.1. Функция 6S РНК .............................................................................................15I.2.2.2. Генетическая организация гена ssrS, процессинг 6S РНК..........................17I.2.2.3.
Механизм функционирования 6S РНК как регулятора транскрипции .....21I.2.3. Характеристика 6S РНК из различных бактерий ................................................30I.2.3.1. Две 6S РНК Legionella pneumophila ..............................................................32I.2.3.2 Две 6S РНК Bacillus subtilis ............................................................................33I.3. Некодирующие РНК, регулирующие активность РНКП II в клетках эукариот .......37I.3.1 FC РНК – аптамер, связывающий РНКП II ..........................................................37I.3.2 Регуляторные РНК, кодируемые SINE-элементами ............................................40I.3.2.1 Alu РНК человека и B1 РНК мыши ...............................................................41I.3.2.2 В2 РНК мыши ..................................................................................................44I.3.3.НекоторыенекодирующиеРНК,регулирующиетранскрипциюпривзаимодействии с транскрипционными факторами .........................................................51I.3.3.1.
7SK и TAR РНК ..............................................................................................51I.3.3.2. SRA РНК ..........................................................................................................57I.3.3.3. U1 мяРНК ........................................................................................................60I.3.3.4. DHFR нкРНК ...................................................................................................61I.3.3.5. GAS5 РНК .......................................................................................................62ГЛАВА II.
Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillus subtilis: сравнительныйанализ свойств и функций (Обсуждение результатов) ................................................ 65II.1. Выделение 6S-1 и 6S-2 РНК Bacillus subtilis ................................................................66II.
2. Выделение РНК-полимеразы Bacillus subtilis .............................................................682II.3. Изучение комплексообразования 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКП .......................................72II.4. Изучение конкуренции между 6S-1/6S-2 РНК и промоторами ДНК в условияхтранскрипции in vitro ..............................................................................................................74II.5. Особенности взаимодействия РНКП с 6S-1 и 6S-2 РНК: синтез пРНК ....................84II.6. Исследование роли 6S-1 и 6S-2 РНК B.
subtilis in vivo ..............................................104II.6.1. Характеристика клеточных линий B. subtilis, используемых для выясненияроли 6S-1 и 6S-2 РНК in vivo ........................................................................................105II.6.2. Синтезируются ли пРНК in vivo?.......................................................................107II.6.3. Влияние делеций генов bsrA и bsrB на экспрессию белков B. subtilis ...........112ГЛАВА III. Экспериментальная часть ...........................................................................
119III.1. Реактивы и материалы .................................................................................................119III.2. Приборы и методы .......................................................................................................123III.3. Общие методики ..........................................................................................................127ВЫВОДЫ ........................................................................................................................ 145СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...............................................................................................
1463СПИСОК СОКРАЩЕНИЙа.к.аминокислотаа.о.аминокислотный остатокБСАбычий сывороточный альбуминБФСбромфеноловый синийкДакилодальтонДНКдезоксирибонуклеиновая кислотаДСНдодецилсульфат натрияДТТ1,4-дитиотреит (трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)ИПТГизопропил-1-тио-β-D-галактопиранозидКиКюри, единица измерения активности веществаКЦксиленцианолмРНКматричная РНКмиРНКмалая интерферирующая РНКмяРНКмалая ядерная РНКмяРНПмалый ядерный рибонуклеопротеидмякРНКмалая ядрышковая РНКНКнуклеиновая кислотанкРНКнекодирующая РНКн.о.нуклеотидный остатокн.п.нуклеотидная параПААГполиакриламидный гельПИКпреинициаторный комплекспРНКpRNA, «product» RNA, продукты транскрипции с 6S РНКРНКрибонуклеиновая кислотаРНКПРНК-полимеразарРНКрибосомная РНКРСАрентгеноструктурный анализТристрис-(гидроксиметил)аминометантРНКтранспортная РНКУФультрафиолетовое излучениеФ.
к.финальная концентрацияЭДТАэтилендиаминтетраацетат, динатриевая сольэтилендиаминтетрауксусной кислоты44×NTPсмесь четырех нуклеозидтрифосфатов (ATP, CTP, GTP, UTP) вэквимолярном соотношенииA. aeolicusAquifex aeolicusAlaаланин, аминокислотаB. subtilisBacillus subtilisCTDС-концевой доменE.
coliEscherichia coliGluглутаминовая аминокислотаGTFgeneral transcription factors, факторы транскрипцииH. pyloriHelicobacter pyloriHEPESN-2-гидроксиэтилпиперазин-N′-2-этансульфоновая кислотаHSFheat-shock transcription factor, транcкрипционный активаторHSPheat shock proteins, белки теплового шокаKdконстанта диссоциации комплексаL. pneumophilaLegionella pneumophilaLBбактериальная питательная среда Luna-BertamMALDI-TOFmatrix-assisted laser desorption / ionization – time of flight,времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией методомлазерной матричной десорбцииNлюбой нуклеотид (A, G, C, T)P.
aeruginosaPseudomonas aeruginosaPDBProtein Data Bank, банк пространственных структур макромолекулPMSFphenylmethanesulfonylfluoride, фенилметилсульфонилфторидS. сerevisiaeSaccharomyces cerevisiaeS. melilotiSinorhizobium melilotiSerсерин, аминокислотаSer-Pфосфорилированная форма серинаSINE-элементыshort interspersed elements, короткие мобильныегенетические элементы (ретротранспозоны)transcription start site, стартовая точка транскрипцииTSSДля обозначения аминокислотных остатков, нуклеозидов, нуклеотидов, олиго- иполинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуреМеждународного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного союзабиохимиков (IUB).5ВВЕДЕНИЕРегуляция экспрессии генов на уровне транскрипции является одним из важнейшихмеханизмов в клетках прокариот.
До недавнего времени считалось, что данный процессконтролируется в первую очередь факторами белковой природы, а также зависит отособенностей конкретных промоторов ДНК. Совершенно неожиданным стало открытие впрокариотахмалыхнекодирующих6SРНК,которыеспособныингибироватьтранскрипцию за счет непосредственного связывания с холоферментом РНК-полимеразы(РНКП) и блокирования её активного центра [1].
Аналоги бактериальных 6S РНК,оказывающие различное действие на транскрипционный аппарат, были найдены в клеткахвысших эукариот, в том числе и человека (Alu РНК, 7SK и U1 мяРНК) [2]. Общностьфункциональных свойств этих некодирующих РНК (нкРНК) позволяет использовать6S РНК прокариот в качестве модели для понимания основ нкРНК-зависимых механизмоврегуляции транскрипции.Основные исследования в данной области проведены для Escherichia coli, в клеткахкоторой содержится только одна 6S РНК. Уникальной особенностью этой 6S РНКявляется возможность синтеза на её матрице коротких транскриптов – пРНК (от англ.«productRNA»,pRNA),которыеостаютсясвязаннымис 6SРНКблагодарякомплементационным взаимодействиям. Образующийся комплекс 6S РНК:пРНК теряетсродство к РНКП, «свободный» фермент вновь способен вести транскрипцию, а 6S РНК ипРНК подвергаются деградации [3].Кроме E.
coli наличие гена 6S РНК (ssrS) предполагается более чем в 130-ти видахбактерий [4], но только для 16-ти их них этот факт подтвержден экспериментально.Немногочисленные данные, известные для 6S РНК из этих бактериальных систем,свидетельствуют о возможном отличии свойств и функций их 6S РНК от 6S РНК E. coli.Объектаминашегоисследованияявляютсядверазличные6S РНКграмположительной бактерии Bacillus subtilis, названные 6S-1 (bsrA) и 6S-2 (bsrB) РНК.6S-1 РНК экспрессируется главным образом в стационарной фазе роста клеток,а максимальная экспрессия 6S-2 РНК приходится на экспоненциальную фазу [4].Причины «появления» дополнительной 6S-2 РНК в условиях активного роста и деленияклеток, а также её свойства и функции, неизвестны и требуют детального исследования.Необходимость исследования механизмов транскрипции генов в бактерии B.
subtilisсвязана с несколькими обстоятельствами. Прежде всего, B. subtilis является хорошоизученным организмом, и последовательность её генома полностью известна [5].C клетками B. subtilis легко проводить разнообразные генетические манипуляции, поэтомуданная бактерия часто выступает в качестве модельного организма в различных6исследованиях. Кроме того, B.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
