Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Позднее незначительное связывание6S РНК было продемонстрировано также в случае σS-РНКП, транскрибирующей гены,активные в стационарной фазе роста клетки [32]. С помощью кросслинкинга поддействием УФ-света РНКП E. coli с гомологичной 6S РНК из Haemophilis influenza, былоустановлено, что 6S РНК образует контакты как с σ70-субъединицей белка, так и с β- иβʹ-субъединицами [1].Количественно содержание 6S РНК в экспоненциальной и стационарной фазах ростабыло оценено, соответственно, как ~ 1000 и ~ 10000 копий на одну клетку. Более того,практически вся σ70-РНКП после роста клеток в течение суток оказывалась в комплексе с6S РНК, тогда как σS-РНКП оставалась активной [1].
Позднее показали [3, 33], чтомаксимальная концентрация 6S РНК наблюдается на стадии выхода клетки изстационарной фазы при попадании в благоприятные условия.На примере σ70-зависимого промотора гена rsd было продемонстрировано, чтоприсутствие 6S РНК значительно снижает уровень транскрипции данного гена.Впоследствии показали, что нокаут гена 6S РНК вызывает повышение уровнятранскрипции σ70-зависимых промоторов, предпочтительно содержащих расширенный -10промоторный элемент с d(TG) в -12 положении и «слабую» -35 промоторную область [34].То есть в нормальных условиях 6S РНК выступает как глобальный ингибитортранскрипции значительного числа генов.В работе [35] было проведено сравнение полных транскриптомов клеток E.
coliдикого типа и нокаутной по гену 6S РНК клеточной линии в средней логарифмической иранней стационарной фазах роста. В общей сложности было выявлено 518 генов,экспрессия которых изменялась в отсутствие 6S РНК более чем в 1,5 раза, причем как всторону увеличения, так и в сторону уменьшения. Из них 245 генов были активны вэкспоненциальной, и 273 – в стационарной фазах клеточного роста.
Изменение уровняэкпрессии наблюдалось для белков, чьи промоторы являлись как σ70-, так и σ38-, σ32- и σ24зависимыми. Как было установлено, многие гены, подверженные регуляции 6S РНК,кодируют транскрипционные факторы (активные, главным образом, в стрессовыхусловиях), транспортные белки и ферменты, вовлеченные в метаболизм пуринов. Нельзяоднозначно утверждать, что влияние 6S РНК на экпрессию того или иного белка являетсяпрямым следствием изменения уровня транскрипции его мРНК. По всей видимости,16многие наблюдаемые эффекты носят косвенный характер, особенно с учетом6S РНК-зависимой регуляции экспрессии транскрипционных факторов. Кроме того6S РНК косвенно может влиять и на синтез регуляторов небелковой природы. Например,отсутствие 6S РНК в стационарной фазе роста клетки вызывало уменьшение уровняэкспрессии белков трансляционного аппарата и рРНК.
Однако такой эффект связывают сувеличением в мутантной клеточной линии концентрации ppGpp – гуанозин-5'-дифосфат3'-дифосфата – основного транскрипционного эффектора в условиях аминокислотногоголодания3. ppGpp может связываться с РНКП вблизи активного центра и в зависимостиот его ориентации (5' или 3'), ингибировать или, наоборот, активировать каталитическуюактивность белка [36].Таким образом, очевидно, что 6S РНК играет важнейшую роль в жинедеятельностиклетки, а её функция рапространяется не только на σ70-зависимые промоторы генов,активных в стационарной фазе роста, но и на огромное количество других генов,активных в тех или иных условиях. Отсутствие фенотипа нокаутных по 6S РНКклеточных линий, по всей видимости, связано с существованием альтернативныхспособов регуляции транскрипции (в том числе активируемых при дефекте синтеза6S РНК), которые полностью или частично компенсируют её отсутствие в клетке.I.2.2.2.
Генетическая организация гена ssrS, процессинг 6S РНКГен ssrS, кодирующий 6S РНК E. coli, транскрибируется совместно с геном ygfA сдвух промоторов P1 (проксимальный) и P2 (дистальный) (рис. I.3) с последующимразрезанием бицистронной РНК [37]. Функция белка, кодируемого геном ygfA, былавыявлена относительно недавно [38] и, по всей видимости, никак не связана с ролью6S РНК в клетке. Он является 5-формилтетрагидрофолатциклолигазой и ингибируетактивностьразличныхфолат-зависимыхферментов.ГенygfE,расположенныйнепосредственно перед геном ssrS, кодирует белок ZapA (Z-ring-associated protein A),который участвует в полимеризации белка FtsZ (производное от filamenting temperaturesensitive mutant Z) в так называемое Z-кольцо, формирующее перегородку между двумядочерними клетками.Оба промотора, с которых происходит транскрипция гена ssrS, активны in vivo.В экпоненциальной фазе роста клеток промотор Р1 в 3 раза сильнее, чем Р2, а припереходе в позднюю стационарную фазу активность обоих промоторов увеличиваетсяодинаково.
Транскрипция с P2 может осуществляться как σ70-РНКП, так и σS-РНКП, в товремя как Р1 является исключительно σ70-зависимым. Таким образом, в экспоненциальной3ppGpp синтезируется белком RelA, ассоциированнымA-участок рибосомы занят деацилированной тРНК [36].срибосомой,втомслучае,если17фазе роста клетки транскрипция 6S РНК происходит одновременно с двух промоторов.При переходе в стационарную фазу проксимальный промотор становится неактивным, атранскрипция с дистального промотора продолжается.Рис. I.3.
Схема расположения гена ssrS, кодирующего 6S РНК в E. coli, и его промоторныхобластей Р1 и Р2. Элементы -35 и -10 промоторов Р1 и Р2 и стартовые точки транскрипции(отмечены стрелками) подчеркнуты и выделены жирным шрифтом. Цифрами указанаотносительная позиция того или иного элемента относительно начала гена ssrS (+1). Индексd (дезокси) при написании последовательностей ДНК опущен.Поскольку инибирование транскрипции в присутствии 6S РНК наблюдаетсяглавным образом в случае σ70-зависимых промоторов, можно предположить, что 6S РНКможет ингибировать и свою собственную транскрипцию.
Для изучения такойвозможности в работе [39] P1 и P2 промоторы гена ssrS были клонированы впромоторную область гена lacZ. Было показано, что нокаут гена 6S РНК никак не влияетна эффективность транскрипции её собственных промоторов in vivo. В то же времясуперэкспрессия 6S РНК вызывала повышение уровня транскрипции с промотора P1 ипонижала активность промотора P2.В условиях in vitro было показано, что ДНК-связывающий белок Fis, регулирующийэкспрессию большого количества генов за счет суперскручивания хромосомы E.
coli,уменьшал уровень транскрипции 6S РНК с промотора P2 и незначительно усилялтранскрипцию с промотора P1 [40]. Поэтому нельзя исключить тот факт, чтотранскрипция 6S РНК регулируется специальными транскрипционными факторами,однако на сегодняшний день в литературе описано крайне мало таких случаев, и ихкорреляция с процессами in vivo остается под вопросом.Наличие двух стартовых точек транскрипции гена ssrS обуславливает существованиедвух форм предшественников 6S РНК – длинной и короткой, оба варианта впоследствииподвергаются процессингу с 5'-конца эндорибонуклеазами: РНКазой Е в случаеР1-транскрипта и РНКазами Е и G в случае Р2-транскрипта (рис. I.4) [41]. Оба вариантапре-6S РНК подвергаются процессингу с одинаковой эффективностью, таким образом,вклад каждого из промоторов в уровень синтеза 6S РНК зависит только от его активности18на той или иной стадии клеточного роста [39].
Ферменты, гидролизующие пре-6S РНК с3'-конца, пока не идентифицированы.Рис. I.4. Модель биогенезиса 6S РНК в клетках E. coli. Холоферменты РНКП, содержащиеразличные σ-факторы обозначены как Eσ70 и EσS [41].Впервые вторичная структура 6S РНК была установлена экспериментально в 2005 г.с помощью метода ферментативного пробинга (рис. I.5) [3]. В том же году былиопубликованы данные сравнительного анализа нуклеотидных последовательностейпредсказанных 6S РНК из 14 различных бактерий (рис. I.6). Несмотря на низкий процентгомологии первичной структуры 6S РНК, все проанализированные последовательностисодержали 4 консервативных элемента CRICRIV, а также с высокой вероятностьюобразовывали протяженную шпильку с большим расплетенным участком в центре состороны 5'-конца молекулы [42].Рис.
I.5. Вторичная структура 6S РНК E. coli [43]. Консервативные элементы CRI-CRIVвыделены синим шрифтом.19Рис. I.6. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 14-ти 6S РНК изразличных бактерий на основе данных BLAST. Консервативные элементы 6S РНК отмечены какCRI-IV [42]. Символом «(» и «)» обозначены н.о., участвующие в комплементационныхвзаимодействиях.20I.2.2.3. Механизм функционирования 6S РНК как регулятора транскрипцииВысокая консервативность вторичной структуры 6S РНК среди различных классовбактерий наряду с отсутствием существенной гомологии первичных последовательностей6S РНК свидетельствовала о важности именно конформации этой нкРНК для еёфункционирования. Было высказано предположение о том, что 6S РНК имитируетпромотор ДНК в его «открытом» комплексе с РНКП, что обеспечивает ее связывание сферментом [4, 44].В дальнейшем было установлено, что 6S РНК E.
coli, так же, как и промотор ДНК,взаимодействует с районом 4.2 σ70-субъединицы РНКП, хотя участки связывания 6S РНКи -35 элемента промотора ДНК полностью не совпадают, но перекрываются (рис. I.7).Следовательно, в основе механизма 6S РНК-зависимого ингибирования транскрипциилежит конкуренция между 6S РНК и -35 промоторной областью ДНК [45].Рис. I.7. Различия в связывании 6S РНК и промотора ДНК с С-концом σ70-субъединицыРНКП.
(А) Аминокислотная последовательность районов 4.1, 4.2 и C-концевого домена σ70; а.о.замененные на Ala выделены красным. (Б, В) Влияние аминокислотных замен на связывание с6S РНК или ДНК, соответственно: красным цветом выделены а.о., замены которых заметноухудшали связывание; желтым цветом обозначены а.о., замены которых вызывали незначительноепонижение сродства белка к лиганду; зеленым цветом отмечены а.о., замены которых увеличивалистепень связывания [45].Неожиданным открытием стала обнаруженная способность 6S РНК, связываясь сактивнымцентромРНКП,служитьматрицейдлясинтезаРНК-продуктовdenovo (рис.
I.8) [3]. Такие короткие транскрипты длиной 18-24 н.о. были названыпРНК (pRNA, «product» RNA). В данном случае ДНК-зависимая РНК-полимераза21проявляла свою исключительную способность выступать в роли РНК-зависимогофермента, о чем не было известно ранее. Открытие в дальнейшем аналогичного процессадля B2 РНК мыши (см. раздел I.3.2.2) заставило ученых пересмотреть концепциюконтроля функционирования РНК-полимеразы исключительно молекулами белков и, повсей видимости, стало отправной точкой для открытия независимого механизмарегуляции активности РНКП с помощью некодирующих РНК.Рис. I.8. Синтез транскриптов (пРНК) на матрице 6S РНК E. coli (A) ПоследовательностьпРНК и расположение стартовой точки инициации её транскрипции (U44, выделен краснымкружком) в 6S РНК E.
coli. (Б) Нуклеотидная последовательность мутантной 6S (М5) РНК,лишенной центрального петли. (В) Транскрипция in vitro в присутствии [α-32P]CTP с матрицы6S РНК (дорожка 2), М5 РНК (дорожка 3) и в отсутствие РНК (дорожка 1, отрицательныйконтроль). Радиоавтограф геля. (Г) Комплексообразование 6S РНК с РНКП в отсутствиеNTP (дорожка 1) и в присутсвии смеси четырех NTP (дорожка 2). Радиоавтограф геля [3].Как и при транскрипции с промотора ДНК, синтез пРНК на 6S РНК в качествематрицы начинается с определенного нуклеотида внутри центрального расплетенногоучастка – транскрипционного «пузыря», аналогично обычному процессу транскрипции.Для 6S РНК E. coli было определено точное положение стартовой точки транскрипции –22U44 (рис. I.8В).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
